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癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)一直以來都備受關(guān)注，今天小編要給大家分享的是一篇發(fā)表在Oncoimmunology（IF:8.11）上題為Landscape of cancer-associated fibroblasts identifies the secreted biglycan as a protumor and immunosuppressive factor in triple-negative breast cancer[1]的文章。就讓我們一起來學(xué)習(xí)這篇文章的研究思路吧~
背景介紹
1.三陰性乳腺癌 (TNBC)
三陰性乳腺癌 (TNBC) 是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體 2 (HER2)均為陰性的一種特殊分子亞型的乳腺癌，約占全部乳腺癌的五分之一，是乳腺癌中預(yù)后相對較差的一類。
2.腫瘤微環(huán)境 (TME)[2]
腫瘤微環(huán)境 (TME) 是指腫瘤周圍的直接生態(tài)位，由代謝環(huán)境中的各種類型的細(xì)胞組成。血管提供氧氣和營養(yǎng)，并負(fù)責(zé)清除廢物；其中的細(xì)胞主要包括基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞通過分泌信號分子和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分來調(diào)節(jié)腫瘤生長。癌細(xì)胞的高代謝活性、血流功能失調(diào)和炎癥增加，導(dǎo)致TME具有生理特性失調(diào)的特點(diǎn)。更詳細(xì)的TME介紹請看Nature metabolism: 腫瘤微環(huán)境中的代謝和免疫。
3.癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF)[3]
癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF)主要是由組織中固有成纖維細(xì)胞或星狀細(xì)胞在生長因子的刺激下轉(zhuǎn)變而來，此外，腫瘤組織中的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）等細(xì)胞也可分化為CAFs。腫瘤組織中的CAFs具有異質(zhì)性，不同亞型CAFs表面標(biāo)志物表達(dá)情況不同。
CAFs 通過分泌各種細(xì)胞因子與其他基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞進(jìn)行信息交流，抑制免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤發(fā)展；也可調(diào)控胞外基質(zhì)，對藥物與免疫細(xì)胞的浸潤產(chǎn)生屏障作用。關(guān)注CAFs在腫瘤微環(huán)境中的功能和機(jī)制可能為乳腺癌治療，特別是免疫治療提供一種策略。想要了解更多的CAF研究思路，請移步火爆全網(wǎng)的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)最全面總結(jié)。
4.METABRIC數(shù)據(jù)庫[4]
METABRIC（乳腺癌國際聯(lián)盟的分子分類學(xué)）是一項加拿大與英國合作項目，旨在根據(jù)有助于確定最佳治療過程的分子特征將乳腺腫瘤分類為更多的亞類。這項研究涉及2000名乳腺癌患者的大型研究，揭示出乳腺癌能夠被劃分為10種亞型?？赏ㄟ^cBioportal（http://www.cbioportal.org/index.do）下載其中的數(shù)據(jù)。
數(shù)據(jù)來源
TCGA數(shù)據(jù)庫中的的TNBC隊列（含116名患者）、METABRIC-TNBC隊列、GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE25066、GSE103091、GSE21653和GSE88715數(shù)據(jù)集以及scRNA-seq數(shù)據(jù)集（GSE114727、GSE136206、GSE138536等）。
分析思路
（上述流程圖主要列舉了文中用到的生信分析方法，除此之外本文還有相關(guān)實驗驗證）
結(jié)果
1. 基于CAF標(biāo)記對TNBC隊列分型
本文作者首先通過查閱文獻(xiàn)收集了研究中報道的典型的CAF markers（包括ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、THY1 和 COL1A1的等），利用這些markers的表達(dá)情況對樣本進(jìn)行聚類，將樣本分為markers高表達(dá)、中表達(dá)及低表達(dá)的三個亞型，并通過PCA來驗證聚類分群的效果。見圖1。
為了進(jìn)一步分析上述不同亞型樣本的成纖維細(xì)胞和免疫特征，作者分別在METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC和GSE25066-TNBC隊列中比較了不同浸潤組中MCP-counter 和 xCell 的成纖維細(xì)胞評分，發(fā)現(xiàn)從低浸潤組到高浸潤組有明顯的上升趨勢。此外，作者還比較了iCAF 和 myCAF 標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果表明高、中浸潤組樣本中有大量CAF標(biāo)志物明顯上調(diào)，這說明這些組中的樣本有大量浸潤的CAF。見圖2。
2. CAFs浸潤與免疫特征的相關(guān)性
我們已知CAF在腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用，于是作者進(jìn)一步研究了CAF與免疫之間的相關(guān)性。他們首先計算了METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC 和 GSE25066-TNBC 隊列中不同浸潤組（高與低、中與低）之間基因的表達(dá)變化，篩選出免疫相關(guān)基因（圖2c、f和i）。其次，作者在高浸潤組和低浸潤組中進(jìn)行了GSVA分析，比較了兩組樣本之間的癌癥標(biāo)志性信號通路，發(fā)現(xiàn)部分免疫相關(guān)信號通路在高浸潤組中顯著富集（圖3a-c）。接下來，作者還評估了CAF與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CAF與CD8+T細(xì)胞和活化的NK細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，同時可能與M2巨噬細(xì)胞有正相關(guān)性（圖3d-f）。
3. BGN上調(diào)并主要在CAF基質(zhì)中表達(dá)
為進(jìn)一步研究與CAF相關(guān)的標(biāo)志物及其相應(yīng)的預(yù)后價值，作者利用RNA測序和質(zhì)譜進(jìn)一步研究分析NAF(正常癌癥相鄰成纖維細(xì)胞)和CAF組之間的差異表達(dá)基因。與NAF相比，BGN(Biglycan)在CAF中顯著上調(diào)，且已有研究表明BGN在治療的抵抗性和免疫活性中發(fā)揮作用。在這里，作者不但在TCGA-TNBC隊列中也觀察到了腫瘤組織中BGN顯著上調(diào)，還利用Western實驗進(jìn)行了驗證。見圖4。
接下來，作者利用TNBC scRNA-seq數(shù)據(jù)在單細(xì)胞層面分析了BGN的表達(dá)情況（圖5），發(fā)現(xiàn)BGN主要在TNBC中的成纖維細(xì)胞群中表達(dá)。同時又在另一個單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)BGN主要在CAF和血管周圍樣（PVL）細(xì)胞群中表達(dá)。而且BGN的表達(dá)水平與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞有顯著的相關(guān)性（圖6）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，BGN可能是TNBC中CAF特異性的生物標(biāo)志物，并在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮其功能。
4. biglycan相關(guān)生物學(xué)和臨床特征
BGN 基因編碼的雙糖鏈蛋白聚糖（biglycan），是一種細(xì)胞外可溶性蛋白質(zhì)，可能通過細(xì)胞間接觸發(fā)揮其功能。作者先是用BGN相關(guān)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與癌癥進(jìn)展和TME調(diào)節(jié)的代表性信號通路在METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC、GSE25066-TNBC隊列中顯著富集。于是作者進(jìn)一步分析了BGN與免疫特征之間的相關(guān)性。首先是分析BGN與免疫相關(guān)基因之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)BGN可能影響免疫細(xì)胞浸潤或調(diào)節(jié)免疫活性。于是作者又計算了BGN表達(dá)水平與STIMATE 分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性，以及BGN與免疫成分之間的相關(guān)性。見圖7。
在文章最后，作者將BGN與臨床進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。首先在表達(dá)水平上，TNBC樣本中的BGN表達(dá)水平明顯低于非TNBC樣本。其次，通過Kaplan-Meier 分析發(fā)現(xiàn)， BGN表達(dá)水平較高的患者的生存情況更差。免疫組化分析也發(fā)現(xiàn)高biglycan表達(dá)的患者樣本總體CD8+T細(xì)胞的浸潤水平更低。生存分析表明，biglycan可能作為 TNBC 的不良預(yù)后標(biāo)志物。見圖8。
小結(jié)
目前而言，在三陰性乳腺癌中CAF與腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用的研究還很少。本文作者通過結(jié)合普通轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)研究了CAF 在TNBC中的作用及其功能的潛在新介質(zhì)，最后確定了一種細(xì)胞外蛋白biglycan，作為TNBC的預(yù)后標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。這篇文章可以說是公共數(shù)據(jù)挖掘加實驗驗證的一個典型套路了。
思路拓展
TME作為腫瘤賴以生存的基礎(chǔ)，為腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲提供物質(zhì)基礎(chǔ)。TME非常復(fù)雜，其與腫瘤代謝和腫瘤免疫系統(tǒng)的相互作用十分密切。CAFs 對腫瘤發(fā)展有著重要的促進(jìn)作用，因此，靶向調(diào)控 CAFs的腫瘤治療策略有望抑制腫瘤進(jìn)展。將這兩者相結(jié)合用以對腫瘤靶向藥的研究分析或?qū)⑷〉弥卮笸黄啤?/p>
在數(shù)據(jù)分析方面，本文所用的數(shù)據(jù)主要是來自于公共數(shù)據(jù)，可見數(shù)據(jù)挖掘還是很重要的。但僅僅只有數(shù)據(jù)挖掘的能力還是不夠的，得學(xué)會最大化利用公共數(shù)據(jù)，將不同類型的數(shù)據(jù)巧妙的結(jié)合起來。就像這項研究中，作者通過結(jié)合常規(guī)轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的數(shù)據(jù)來分析CAFs，既描述了基于CAF的不同樣本分析，還描述了TNBC中CAF相關(guān)的marker基因在不同細(xì)胞的表達(dá)情況。不難發(fā)現(xiàn)，目前常規(guī)轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞的結(jié)合是一個非?；鸬姆治鍪侄巍?/p>
參考文獻(xiàn)
