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了解腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞表型，對了解癌癥進展和免疫治療機制至關(guān)重要 。今天小編給大家介紹一篇發(fā)表于《Communications Biology》(IF=6.331)雜志上的文章。該文章運用單細胞 RNA 測序 (SCRS) 和 T 細胞受體 (TCR) 測序來表征透明腎細胞癌(ccRCC) 的腫瘤免疫微環(huán)境。

摘要

透明細胞腎細胞癌(ccRCC)是最常見的腎細胞癌類型，占所有腎癌的70%以上。ccRCC同時也是最具免疫特異性的腫瘤類型之一，盡管腫瘤的突變率較低，但免疫治療時具有高應答率。為了表征 ccRCC 的腫瘤免疫微環(huán)境，研究者采用單細胞 RNA 測序 (SCRS) 和 T 細胞受體 (TCR) 測序來繪制3例ccRCC患者匹配的腫瘤和血液中 25,688 個 CD45⁺ 淋巴細胞和骨髓細胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。另外納入4個個體的11367個來自腎臟和外周血的免疫細胞，以促進ccRCC特異性差異的識別和評估。與正常腎組織相比，腫瘤浸潤免疫細胞中CD8⁺ T細胞和巨噬細胞數(shù)量總體增加。證明了腫瘤浸潤性CD8⁺ T細胞的分化及轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，并確定了MKI67 ⁺增殖亞群是促進ccRCC進展的潛在元兇。研究人員利用SCRS的基因表達結(jié)果，通過亞群分配對臨床結(jié)果和病理疾病進行優(yōu)先預測。隨著進一步的表征和功能驗證，其結(jié)果可能揭示某些免疫細胞亞群可耐受治療干預。

結(jié)果

1、ccRCC中免疫細胞單細胞表達譜繪制

研究者對來自ccRCC腫瘤的淋巴細胞和髓細胞以及三名未接受治療的ccRCC患者的外周血進行了SCRS。其技術(shù)流程見圖1。在這些樣本中，研究者添加了來自正常人外周血和正常腎實質(zhì)的免疫細胞，從而在37,055個原代免疫細胞中獲得了22個簇的UMAP投影(圖2a)。在三種組織中，簇0、1、3和7具有相似的基因表達(圖2b)，外周血大部分富集于簇2，腫瘤組織在簇14、17、18和19中富集，正常腎臟在簇11中富集?；诨虮磉_，研究人員用三種方法將細胞譜系分配給每個簇：

(1)    T細胞(CD3E, CD8A、CD4和IL7R或CD127) 典型標記物的表達, B細胞(CD19和MS4A1),髓細胞(CD14和FCGR3A或CD16),和自然殺傷細胞(KLRD1和NKG7)(圖2c)

(2)    通過ENCODE沉淀純化的細胞群的基因特征的相關(guān)性(圖2d)

(3)    基于TCR測序的T細胞克隆型分配。

基于這些方法研究人員通過注釋單核細胞(簇0、5、11、12和16),CD4 ⁺ T細胞(簇4、6、10、13、15和20),CD8 ⁺ T細胞(簇1、8、9、17),NK細胞(簇3和7),B細胞(簇2),巨噬細胞(簇14),樹突細胞(DC,簇18和19)，在正常腎臟或腫瘤中CD4⁺ T細胞和B細胞相對于外周血減少。然而有意思的是，在腫瘤中CD8⁺ T細胞和巨噬細胞相對于外周血增加(圖2e)，這與預期結(jié)果相反。對配對的正常和腫瘤組織進行高通量免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)與來自ccRCC患者樣本的正常腎組織相比，腫瘤組織中CD8⁺ T細胞的增加和CD4⁺ T細胞的減少具有相似的趨勢（圖3）

2.外周血與腫瘤CD8⁺淋巴細胞優(yōu)先重疊

研究者研究ccRCC中CD4⁺和CD8⁺ T細胞克隆物種的動態(tài)變化，為TCRA和TCRB分配TCRR序列，并通過基因和核苷酸序列的組合來定義克隆型。主要在CD8⁺ T細胞群中觀察到克隆型頻率的增加（圖4 a), 在所分配的NK3和NK7細胞簇中有擴增的克隆型，但是在其他T細胞簇中也觀察到這些克隆型，表明T細胞的可能亞組與NK3或NK3基因表達重疊。在T細胞分類時，研究人員注意到在ccRCC患者中，CD8⁺ T細胞前10個克隆細胞與CD4⁺ T細胞所占的克隆型空間存在顯著差異(圖4b)。這種趨勢在腫瘤浸潤和外周血CD8⁺ T細胞之間保持一致。與CD4 ⁺ T細胞相比，CD8 ⁺ T細胞中共用克隆類型的相對患者特異性增加，且CD8⁺和CD4⁺ T細胞的患者克隆類型之間的重疊極?。▓D4 c)。根據(jù)CD8⁺克隆型患者特異性重疊顯示，外周血克隆型相對較多(圖4d)。有趣的發(fā)現(xiàn)是，三號病人腫瘤晚期(患者1和2的pT3a與T1相比)在腫瘤特異性克隆型中顯示擴增，而在血液中未見(圖4d)。在3個 ccRCC晚期患者中，兩種克隆型共占619個CD8⁺ T細胞，分布在UMAP群中(圖4e)，這支持T細胞克隆型既不是UMAP簇的決定因素，也不是功能指征的決定因素。這種與耗盡基因表達相關(guān)的克隆型分區(qū)可能反映了腫瘤本身的擴張起源。

3.CD8⁺ T細胞在ccRCC腫瘤中表現(xiàn)出不同人群的轉(zhuǎn)錄連續(xù)性

CD8⁺ T細胞的亞簇顯示了八個不同的簇 (圖5a)，且具有相對的組織特異性分布 (圖5b)。組織浸潤的CD8⁺ T細胞 (腫瘤和正常腎臟) 主要包括CD8_0，CD8_1，CD8_3，CD8_5，CD8_6和CD8_7，其中只有集群CD8_2和CD8_4的外周血細胞相對水平增加 (圖5b)。研究人員檢查了增殖基因特征的變異，發(fā)現(xiàn)具有與組織類型相似的分布，S或G2M期細胞從右到左增加，在簇CD8_6達到峰值 (圖5c)。為了更好地描述CD8⁺簇，研究人員使用典型和差異的T細胞標記物來檢測UMAP沿線的基因表達差異(圖5d)。為了檢查單個或選定基因的基因表達模式，研究人員使slingshot在子簇之間建立最小生成樹，基于最多樣化的基因生成曲線，除B1延伸至CD8_2外，其余曲線沿類似軌跡繪制，具有CD8_1的共同節(jié)點，并在不同簇上分支，腫瘤浸潤CD8⁺T細胞水平增加(圖5e)。在特定的克隆型序列中也觀察到這種克隆型關(guān)系，在亞群CD8_0、CD8_6、CD8_5和CD8_3中可以看到重疊的克隆型（圖5f）。相比之下，CD8_7與其他亞群的重疊克隆型最少（圖5f）?；蚣患l(fā)現(xiàn)，簇CD8_0和CD8_5顯示與終末端分化和衰竭增加相關(guān)。高度增殖的CD8_6群體代謝活動而豐富，如三羧酸循環(huán)和糖酵解，以及DNA修復（圖5g）。研究與抗PD-1療法的反應或無反應相關(guān)的特征的富集（圖5h），使用序數(shù)在構(gòu)建軌跡時，為細胞創(chuàng)建了一個偽時間變量，這有利于能夠看到沿曲線的富集差異。

4.ccRCC中的CD4⁺ T細胞特征確定了不同的腫瘤內(nèi)人群

CD4⁺ T細胞可以通過通過細胞溶解機制，也可以間接通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境來影響癌癥的發(fā)病機制。CD4⁺T細胞亞群顯示出9個不同的簇（圖6a）其模式與組織分布的CD8⁺ T細胞相似，右側(cè)主要為外周血CD4⁺ T細胞，左側(cè)為組織浸潤性CD4⁺T細胞（圖6b）。與CD8⁺ T細胞一樣，研究人員檢查了UMAP沿線的典型和差異性T細胞標記（圖6c）。在腫瘤浸潤性CD4_4簇中，觀察到Th1驅(qū)動因子TBX21（T-bet）、激活標記物LAG3和NR4A2的表達增加以及細胞因子的表達（圖6c）?；贑D4 ⁺子簇構(gòu)建單元軌跡曲線，可以看到CCR8 ⁺ SELL⁺ OSM6 ⁺簇CD4_1和CD4_3的兩個根點，導致共同的CD4_4終止（圖6d）。與其他CD4⁺ T細胞不同，Tregs產(chǎn)生的曲線是發(fā)散的，從CD4_6到CD4_7并進入CD4_4（圖6d）。與其他腫瘤浸潤的CD4⁺ T細胞相比，這可能代表了Tregs（由CD4_6和CD4_7共享）的獨特表達模式。此外，與CD8⁺亞簇相比，CD4_4和CD4_5中出現(xiàn)適度的克隆擴張，且細胞軌跡不清晰(圖6e)。在腫瘤浸潤的CD4⁺T細胞中上調(diào)的是熱休克蛋白（HSPA1A和HSPA1B）、Jun和FOS成分（FOS、JUN和JUNB）、MHC-II分子（HLA-DRB）和分泌因子（CCL5、GZMA和GZMK）。CD4_6集群增加了IL-6細胞因子、OSM6、AREG和SOCS3在白細胞介素信號傳導下游的表達（圖6f）。差異表達與通路分析緊密匹配，富含細胞溶解和I型干擾素信號傳導的CD4_4。CD4_6和CD4_7 Treg簇優(yōu)先富集代謝途徑，在腫瘤浸潤的CD4_5中具有高水平的終端分化。OSM^high CD4_6富集IL-6/JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導和炎癥反應基因(圖6g)。

5.在ccRCC中，浸潤性巨噬細胞明顯具有轉(zhuǎn)錄分化。

在單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞中，亞聚類發(fā)現(xiàn)了 20 個不同的簇（圖 7a）。 觀察到組織特異性分布，大多數(shù)腫瘤浸潤性骨髓細胞位于亞群 0、3、7、8 和 15 中（圖 5b）。相反，正常腎實質(zhì)和外周血均由大多數(shù)單核細胞亞群組成（圖7b）。使用CD1C、CLEC10A（CD301）、FCER1A和MSR1等標記鑒定的巨噬細胞亞群（0、3、7、13和14）（圖7c）?？偟膩碚f，與外周血相比，組織浸潤性骨髓細胞中 CD14⁺ 單核細胞的比例降低，巨噬細胞增加。 正常腎實質(zhì)的 CD14^-_、CD16^-單核細胞有不同程度的增加，但并不顯著（圖 7d）。接下來作者分離了五個巨噬細胞亞群，根據(jù)來自各自組織的細胞的相對百分比重新標記它們與腫瘤相關(guān)的巨噬細胞1 (TAM_1)，TAM_2，TAM_3，常駐巨噬細胞 (rM) 和外周巨噬細胞 (pM) (圖7e)。盡管沿著保持整體表達結(jié)構(gòu)的UMAP的分布相似，但這五個簇具有不同的表達模式 (圖7e)。不同巨噬細胞亞群的表達具有差異性（圖7f）。研究人員建立了基于不同基因的細胞軌跡，并發(fā)現(xiàn)兩條不同的曲線會聚到TAM_3和pM中 (圖7g)。為了評估巨噬細胞的潛在功能差異，進行了基因集富集分析 (圖7h)。

6.CD8⁺ T 細胞和 TAM 亞群的不同預后意義

研究者證明了 ccRCC 中 CD8⁺ T 細胞和 TAM 的轉(zhuǎn)錄差異，為了驗證這些轉(zhuǎn)錄差異是否導致腫瘤反應的功能差異，研究者試圖從SCRS 數(shù)據(jù)中開發(fā)出具有預后價值的基因特征（圖 8a）。通過訓練結(jié)果為每種細胞類型選擇最優(yōu)模型。將模型應用于267個原發(fā)性腫瘤的測試隊列，發(fā)現(xiàn)CD8_6和TAM_3這兩個特征的總體存活率較高（圖 8b）。同時還觀察到不良預后預測與組織學分級增加有關(guān)（圖8c）。在每個特征中，跨基因的組織學分級的表達沒有明顯的關(guān)聯(lián)（圖9）。然而，CD8_6 和 TAM_3 分類之間存在顯著關(guān)聯(lián)，在分類為良好預后和預后不良的患者中有高度重疊，但 CD8_6 簽名更廣泛地適用于區(qū)分 TCGA 數(shù)據(jù)集的總體存活率（圖10）。研究者使用從四個健康組織樣本中分離的T細胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在14.6%的CD45⁺ 、CD3⁺ 、CD8⁺ T細胞中發(fā)現(xiàn)了PD-1⁺ 、Ki-67^Hi亞群(圖8d)。除PD-1外，與其他CD45⁺ 、CD3⁺ 、CD8⁺ T細胞相比，ccRCC中CD8⁺ T細胞增殖亞群的CTLA-4、ICOS、4-1BB (CD137)、TIM-3、HLA-DR和CD38水平升高(圖8e)。通過計算樣本中PD-1⁺  、Ki-67^Hi細胞占CD8⁺ T細胞總數(shù)的比例，發(fā)現(xiàn)PD-1⁺  、Ki-67^Hi細胞最高三分位的CD8_6基因簽名分配具有類似的分布(圖8f)。

總結(jié)

隨著對免疫療法工作原理的進一步了解，腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的表型和功能特征影響預后和疾病結(jié)果。全面了解基因特征以充分了解特定免疫群體在癌癥中的作用具有高度的病理相關(guān)性；不僅可以發(fā)現(xiàn)癌癥進展的免疫失調(diào)決定因素，還可作為選擇患者、評估免疫治療獲益可能性和進一步確定臨床顯著亞群的有用工具。盡管免疫治療是晚期和未經(jīng)治療的ccRCC的主要治療手段，但與其他免疫治療反應性腫瘤相比，ccRCC腫瘤有許多違反直覺的免疫發(fā)現(xiàn)。這些截然不同的發(fā)現(xiàn)表明，ccRCC腫瘤的免疫區(qū)之間存在著更復雜的相互關(guān)系。