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小伙伴們，大家早上好，今天和大家分享的文獻(xiàn)是近期發(fā)表在《Respiratory Research》（IF：7.16）雜志上，本文通過生信分析和基因敲除的驗證，全面分析了CENPO在泛癌中的作用，思路清晰，讓我們一起學(xué)習(xí)吧！！
Pan?cancer landscape of CENPO and its underlying mechanism in LUAD
摘要
著絲粒蛋白O (CENPO)是一種新發(fā)現(xiàn)的組成性著絲粒蛋白，與細(xì)胞死亡有關(guān)。然而，關(guān)于CENPO表達(dá)如何與人類癌癥或免疫浸潤相關(guān)，我們知之甚少。本文作者通過體外和體內(nèi)實驗評估了CENPO在泛癌中的作用，并進(jìn)一步驗證了在肺腺癌(LUAD)中的結(jié)果。
癌癥縮寫：
BLCA：膀胱移行細(xì)胞癌；BRCA：乳腺浸潤性癌；CESC：宮頸癌和子宮頸癌；CHOL：肝膽管型肝癌;COAD: 結(jié)腸腺癌;ESCA: 食管癌;GBM: 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;HNSC: 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌;LIHC: 肝細(xì)胞癌;LUAD：肺腺癌;LUSC：肺鱗癌;READ:直腸腺癌；STAD: 胃腺癌;UCEC:子宮內(nèi)膜癌
1.CENPO在各種人類癌癥中的上調(diào)
首先，利用GTEx數(shù)據(jù)庫分析CENPO的表達(dá)情況，在大多數(shù)正常人體組織中，可以檢測到CENPO mRNA的表達(dá)水平(圖2A)。CENPO基因在正常人EBV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞、睪丸、脛骨神經(jīng)、培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、皮下脂肪組織、子宮頸，卵巢中高表達(dá)（圖2B）。利用Sangerbox數(shù)據(jù)庫研究泛癌中CENPO的表達(dá)水平，CENPO在大多數(shù)癌癥中上調(diào)，但是在甲狀腺癌(THCA)和腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)中下調(diào)。作者使用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析了TCGA數(shù)據(jù)集中的CENPO表達(dá)。發(fā)現(xiàn)CENPO在大多數(shù)癌癥中上調(diào)(圖2C)，包括BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、LIHC、LUAD、LUSC、前列腺腺癌(PRAD)、READ、STAD和UCEC。但是在KICH、THCA和腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)中也呈負(fù)性調(diào)節(jié)(圖2C)。此外，與相應(yīng)的正常樣本相比，在配對的腫瘤樣本中，分別有23種癌癥的CENPO表達(dá)顯著增加(圖2D)。作者又分析了CENPO與GEPIA2網(wǎng)站上的泛癌階段之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CENPO與腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)、BRCA、KICH、KIRP、LIHC、LUSC、OV和LUAD的分期顯著相關(guān)(圖2E)。這些結(jié)果表明，CENPO在各種類型的癌癥中表達(dá)上調(diào)，表明CENPO可能在癌癥診斷中發(fā)揮潛在的關(guān)鍵作用。
2.CENPO在泛癌中的診斷和預(yù)后作用
利用ROC曲線評估了CENPO對多種類型癌癥的診斷，CENPO可以作為一些癌癥很好的預(yù)后標(biāo)記物（圖3A）。此外，CENPO水平的增加與ACC 、KICH、LIHC、LUAD、肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、LGG、SKCM和間皮瘤較差的生存相關(guān)（圖3B）。相比之下，在READ中，CENPO表達(dá)增加與更好的OS相關(guān) (圖3B)。此外，DFS結(jié)果還顯示，在ACC、KICH、LIHC、LUAD、SARC、UVM、LGG、SKCM和MESO (p = 0.08)中，CENPO表達(dá)增加與預(yù)后較差相關(guān)（圖3C）。
3.CENPO參與泛癌的免疫浸潤
作者評估了泛癌中ESTIMATE評分和CENPO表達(dá)之間的關(guān)系，在一些癌癥中，CENPO表達(dá)與ESTIMATE、免疫和基質(zhì)評分呈負(fù)相關(guān)（圖4A）。表明在一些腫瘤中，CENPO的高表達(dá)與免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞浸潤減少有關(guān)，從而導(dǎo)致腫瘤純度高。相反，有一部分癌癥中，CENPO表達(dá)與ESTIMATE、免疫和基質(zhì)評分呈正相關(guān)(圖4A)。然后作者利用Sangerbox數(shù)據(jù)庫研究了不同腫瘤中CENPO表達(dá)與腫瘤中浸潤免疫細(xì)胞水平之間的關(guān)系，CENPO表達(dá)與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系在不同類型的腫瘤中有很大的差異，這取決于免疫細(xì)胞的類型（圖4B）。
還研究了CENPO表達(dá)水平與腫瘤突變負(fù)荷（TMB）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）或MATH之間的關(guān)系，以確定CENPO是否是多種癌癥免疫治療反應(yīng)的預(yù)測因子。在一些癌癥中，CENPO表達(dá)與TMB呈正相關(guān)（圖4C）。此外，有一部分癌癥，CENPO的表達(dá)與MSI呈正相關(guān)，而在GBML 、KIPAN和PRAD中與MSI呈負(fù)相關(guān)。(圖4D)。一部分癌癥中，CENPO的表達(dá)與MATH呈正相關(guān)，而在另一部分中與MATH呈負(fù)相關(guān)(圖4E)。
免疫檢查點(ICP)封鎖蛋白是最有希望的癌癥免疫治療靶點。因此，作者分析了在多種癌癥類型中ICP基因表達(dá)水平與CENPO的關(guān)系。在大多數(shù)腫瘤中，CENPO表達(dá)與ICP基因呈正相關(guān)。在THYM中，CENPO表達(dá)與大多數(shù)ICP基因呈負(fù)相關(guān)（圖4F）。
綜上所述，CENPO在泛癌的免疫浸潤中發(fā)揮重要作用，可能成為腫瘤治療中的一個新的免疫治療靶點。
使用TIMER 2.0研究了CENPO在免疫細(xì)胞浸潤中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤中，髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)浸潤水平與CENPO表達(dá)顯著正相關(guān)(圖5A); 排在前6位的腫瘤分別為ACC、ESCA、LIHC、LUAD、READ和UCEC (圖5B)。在大多數(shù)腫瘤中T細(xì)胞NK的浸潤水平與CENPO的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖5C); 排在前6位的腫瘤分別為BRCA-Her2、CHOL、PRAD、SARC、THCA和THYM (圖5D)。
通過TISIDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析了CENPO與趨化因子和趨化因子受體的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CENPO的表達(dá)與大多數(shù)趨化因子呈負(fù)相關(guān)(圖6A)。圖6B顯示了18種趨化因子受體與CENPO表達(dá)的相關(guān)性，并觀察到在LUAD中，CENPO與3種趨化因子受體呈負(fù)相關(guān)。CENPO表達(dá)與大多數(shù)組織相容性復(fù)合體(MHC)呈負(fù)相關(guān)，對于LUAD, CENPO表達(dá)與12種MHCs呈負(fù)相關(guān)。
4.LUAD中CENPO突變的特點
作者分析了TCGA隊列中CENPO突變狀態(tài)，在32種癌癥中觀察到CENPO改變，其中子宮癌的發(fā)病率最高（圖7A）。圖7B還顯示了CENPO突變位點、類型和數(shù)量。然后在TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集上分析CENPO表達(dá)與體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)變異(CNVs)等特定基因組特征之間的關(guān)系。CENPOhigh組顯示TP53、TTN、CSMD3、MUC16和ZFHX4基因的高頻率體細(xì)胞突變，CENPOlow組顯示TP53、MUC16、TTN、CSMD3和RYR2的高頻率突變(圖7C)。
5.CENPO在LUAD中的功能分析
通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫探討了CENPO在LUAD中的生物學(xué)功能，前50個基因與CENPO呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因如圖所示（圖8A-C）。GO分析結(jié)果顯示CENPO主要涉及DNA依賴的DNA復(fù)制、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期相變、細(xì)胞周期過程等(圖8D)。KEGG分析顯示在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、剪接體、蛋白酶體、藥物代謝等方面富集(圖8E)。CENPO與前兩個顯著富集的信號通路(包括細(xì)胞周期和DNA復(fù)制)的相關(guān)性，其中CENPO與細(xì)胞周期蛋白(包括CDK1、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CCNEA、CCNE2和CDKN2A)顯著相關(guān)(圖8F)。表明CENPO可能在LUAD的細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
6.LUAD中調(diào)節(jié)CENPO表達(dá)及相互作用基因的ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
lncRNAs調(diào)控mRNA的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。作者構(gòu)建了LUAD中可能調(diào)控CENPO的表達(dá)lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)miRDB、miRWalk、Targetscan和miRabel數(shù)據(jù)庫，確定了82個可以靶向CENPO的miRNAs(圖9A)。又分析了在TCGA-LUAD中與患者生存顯著相關(guān)miRNAs，得到了43個miRNAs。在兩組的交點只有miR-370(圖9B)。表明hsa-miR-370可以靶向LUAD中CENPO的表達(dá)。通過LncBase數(shù)據(jù)庫識別到了61個可以靶向hsa-miR-370的lncRNA，其中只有10個lncRNA與LUAD患者的預(yù)后顯著相關(guān)(圖9D)。利用83個miRNA和10個lncRNA構(gòu)建lncRNA-miRNA-CENPO調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖9C)?；贖ALLMARK的前5個正向富集的通路是“E2F靶標(biāo)”、“G2M檢查點”、“有絲分裂紡梭體”、“mtorc1信號通路”和“MYC靶標(biāo)”(圖9E)。KEGG富集結(jié)果，最顯著的正富集途徑是細(xì)胞周期，而最顯著的負(fù)富集途徑是哮喘、藥物代謝細(xì)胞色素P450、腸免疫網(wǎng)絡(luò)生成Ig A和視黃醇代謝(圖9F)。
利用CancerSEA的單細(xì)胞序列數(shù)據(jù)分析了CENPO和18種癌癥的功能狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。CENPO與大多數(shù)癌癥的細(xì)胞周期、DNA損傷和DNA修復(fù)呈正相關(guān)(圖10A)。CENPO與大多數(shù)癌癥的缺氧和血管生成呈負(fù)相關(guān)(圖10A)。在LUAD中，CENPO表達(dá)與細(xì)胞周期(、DNA損傷、DNA修復(fù)、侵襲、增殖顯著正相關(guān)(圖10B)，與炎癥負(fù)相關(guān)(圖10B)。p = 0.0016)和分化 (圖10C)。
7.CENPO下調(diào)可誘導(dǎo)LUAD細(xì)胞凋亡和G2阻滯
上述的生信分析發(fā)下CENPO與細(xì)胞周期顯著相關(guān)，作者利用GEPIA2.0數(shù)據(jù)庫分析CENPO和CDK家族和Cyclin家族之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CENPO與CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CCNA、CCNB、CCNC和CCNE呈正相關(guān)(圖11A)。通過細(xì)胞系的培養(yǎng)和敲除發(fā)現(xiàn)，CENPO的沉默顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖11B)和G2的阻滯(圖11C)。
綜上所述，CENPO敲除的LUAD細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯周期為G2/M期。
8.CENPO基因敲除通過mTOR信號通路抑制LUAD細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移
作者進(jìn)一步研究了CENPO對細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。IHC染色顯示，在LUAD組織中，CENPO顯著上調(diào)(圖12A)。Mann-Whitney U分析顯示，CENPO表達(dá)與腫瘤分期顯著正相關(guān)。在75個LUAD組織中，36個組織和4個正常組織中發(fā)現(xiàn)CENPO高表達(dá) (圖12B)。Pearson相關(guān)分析進(jìn)一步表明，CENPO高表達(dá)可預(yù)測LUAD患者病情惡化，腫瘤分期越高，CENPO高表達(dá)患者比例越高(圖12C)。
Celigo染色結(jié)果表明，CENPO基因下調(diào)可抑制A549和HCI-H1299細(xì)胞的增殖。Transwell腔室顯微照片顯示shCENPO組細(xì)胞明顯少于shCtrl組(圖13A)。與shCtrl組相比，shCENPO組A549和HCI-H1299細(xì)胞在48 h和36 h內(nèi)的遷移能力分別顯著下降。每個區(qū)域侵襲細(xì)胞特異性顯示A549和HCI-H1299細(xì)胞明顯減少(圖13B-C)。
通過對小鼠異種移植模型的持續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，shCENPO組小鼠腫瘤體積明顯小于shCtrl組(圖14A-B)。CENPO基因敲除后，腫瘤的平均重量明顯下降(圖14C)。當(dāng)日監(jiān)測結(jié)果顯示，shCENPO組的熒光強(qiáng)度顯著高于shCtrl組(圖14D)。隨后，免疫組化和HE染色顯示，與shCtrl組相比，shCENPO組表達(dá)KI67信號和炎癥損傷的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖14E)。此外，總結(jié)了下游信號通路的研究結(jié)果，CENPO表達(dá)的降低降低了NCI-H1299細(xì)胞中mTOR磷酸化水平，負(fù)向調(diào)節(jié)CDK1、CDK6和PIK3CA(圖14F)。因此，作者認(rèn)為CENPO下調(diào)可能通過介導(dǎo)PIK3CA /mTOR信號通路抑制LUAD。
小結(jié)
本文主要研究泛癌中CENPO的作用，在分析的過程中，通過不同的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，無論是樣本量還是后期的驗證都是具有很強(qiáng)的說服力的。涉及到的癌癥類型也很多，以及后續(xù)在LUAD中進(jìn)一步的驗證做的方法都是很值得我們學(xué)習(xí)的。在大多數(shù)癌癥中，CENPO上調(diào)和突變，這預(yù)示了較差的預(yù)后。CENPO敲除抑制LUAD細(xì)胞的惡性表型，表現(xiàn)為增殖減慢、G2周期縮短、凋亡增加、遷移減少和腫瘤發(fā)生減弱。此外，CENPO敲除降低CDK1/6, PIK3CA，抑制mTOR磷酸化，提示mTOR信號通路可能參與CENPO介導(dǎo)的LUAD發(fā)育調(diào)控。在濕實驗小鼠體內(nèi)和基因敲除都得到了很好的結(jié)果和驗證。
