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各位小伙伴大家好??！今天給大家分享的文章題為《頭頸癌的單細(xì)胞分析揭示了早期轉(zhuǎn)移過程中潛在的免疫逃逸機(jī)制》，于今年3月發(fā)表在Nature Communications（IF=17.694）雜志。
作者提到大多數(shù)的研究側(cè)重于轉(zhuǎn)移的終末事件和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的作用，然而頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的bulk分析卻發(fā)現(xiàn)EMT不是HNSCC淋巴轉(zhuǎn)移的先決條件，所以作者重點(diǎn)關(guān)注跨腫瘤組織和淋巴結(jié)的細(xì)胞類型（癌細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞），解析相關(guān)機(jī)制，并進(jìn)一步分析了潛在的治療靶點(diǎn)。小編認(rèn)為，科學(xué)研究就應(yīng)該善于發(fā)現(xiàn)問題，并大膽開展研究。接下來，我們一起學(xué)習(xí)一下這篇文章吧。
結(jié)果一、原發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HNSCC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)
為了描繪原發(fā)性腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的“全腫瘤”單細(xì)胞景觀，作者開發(fā)了一種方案來快速處理新鮮切除的組織以進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序和建立原代培養(yǎng)物（圖1a）。14例局部晚期HPV陰性HNSCC患者原發(fā)瘤和頸部淋巴結(jié)組織的53459個(gè)細(xì)胞通過Seurat聚類分為上皮細(xì)胞、唾液細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（圖1b、c）。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位之間的細(xì)胞組成存在差異（圖1d），原發(fā)腫瘤中CAFs和TAMs的比例更高，而轉(zhuǎn)移部位的B細(xì)胞、漿細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞更多，與TCGA的bulk數(shù)據(jù)得出的細(xì)胞組成相似。此外，InferCNA發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞中95%出現(xiàn)拷貝數(shù)變化，因此該亞群主要是癌細(xì)胞（圖1e）。
圖1
結(jié)果二、腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中表現(xiàn)出不同程度的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化
接下來，作者提取了具有拷貝數(shù)變異的上皮細(xì)胞作為腫瘤細(xì)胞進(jìn)行重聚類，發(fā)現(xiàn)原發(fā)瘤和淋巴轉(zhuǎn)移的細(xì)胞存在重疊（圖2a）。作者為了識(shí)別來自原發(fā)瘤的具有轉(zhuǎn)移到淋巴組織的結(jié)前細(xì)胞，分析了不同樣本的細(xì)胞簇，并比較了原發(fā)瘤和淋巴轉(zhuǎn)移人群中的EMT基因，發(fā)現(xiàn)除HN257外，所有患者的淋巴結(jié)腫瘤細(xì)胞的EMT評(píng)分高于相應(yīng)的原發(fā)瘤（圖2b）。
然后作者通過Monocle構(gòu)建了軌跡以鑒定與淋巴結(jié)上皮細(xì)胞“最近鄰”的原發(fā)瘤細(xì)胞。根據(jù)起源和方向標(biāo)記軌跡，結(jié)合EMT評(píng)分和CytoTRACE鑒定出三種模式（圖2c、d）：第一種，偽時(shí)序顯示從原發(fā)瘤到淋巴轉(zhuǎn)移的有序，進(jìn)行性，逐步過渡，并且原發(fā)性腫瘤幾乎沒有進(jìn)一步進(jìn)展，偽時(shí)序過度的主要途徑包括上皮去分化、氧化磷酸化和EMT（圖2e）；第二種是淋巴結(jié)前細(xì)胞的途徑繼續(xù)明顯的軌跡，并且原發(fā)瘤也顯示出持續(xù)進(jìn)化。GeneSwitch算法也鑒定出這兩種模式中進(jìn)一步識(shí)別了原發(fā)瘤細(xì)胞到結(jié)前細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因上AXL，Aurora激酶，TYMS和STAT2（圖2f）。第三種模式中腫瘤軌跡是隨意的，沒有方向性，并且沒有證據(jù)表明原發(fā)腫瘤在進(jìn)化上處于“更早”的時(shí)間點(diǎn)（圖2g）。作者因此假設(shè)這個(gè)細(xì)胞亞群是快速發(fā)展且具有侵襲性的細(xì)胞亞群，差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)該亞群132個(gè)上調(diào)基因參與氧化磷酸化和腫瘤代謝，而45個(gè)下調(diào)基因參與免疫逃逸（圖h），TCGA數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)相同的特征的樣本具有較差預(yù)后（圖2i）。因此，作者假設(shè)原發(fā)瘤中的不同亞群顯示出更具侵襲性的表型，可能在淋巴結(jié)播散發(fā)生后進(jìn)一步進(jìn)化。
圖2
結(jié)果三、識(shí)別轉(zhuǎn)移前腫瘤細(xì)胞的弱點(diǎn)
作者為了識(shí)別這個(gè)過程中治療干預(yù)的機(jī)會(huì)，對(duì)患者原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中細(xì)胞衍生物進(jìn)行分析。使用Seurat和PAGODA進(jìn)行后續(xù)分析（圖3a），發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞簇是基于患者的，并且原發(fā)瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分離，而EMT是分化的主要途徑之一（圖2b）。作者將HN137、HN159和HN220中的結(jié)前細(xì)胞確定為與轉(zhuǎn)移細(xì)胞聚集在一起的小初級(jí)亞群。這些結(jié)前細(xì)胞的差異分析將AXL（HN137）和AURKB（HN159和HN220）確定為可能的目標(biāo)（圖3c），并用免疫組織化學(xué)或免疫熒光染色驗(yàn)證了腫瘤組織中兩個(gè)基因的表達(dá)（圖3d）。通過AXL和AURKB的特異性抑制劑BGB324和barasertib處理患者的原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)經(jīng)對(duì)應(yīng)藥物處理的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞與未處理細(xì)胞相比，都有較低的細(xì)胞遷移、侵襲（圖3e-g），而且與AXL低細(xì)胞相比，BGB324僅在AXL高原發(fā)瘤亞群中特異性抑制侵襲（圖3h、i）。結(jié)果bulk數(shù)據(jù)驗(yàn)證ALX或AURKB與EMT之間的相關(guān)性后，作者認(rèn)為AXL和AURKB在侵襲中起著重要作用，并可以作為抗轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)。
圖3
結(jié)果四、原發(fā)瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位中的CD8+ T細(xì)胞的進(jìn)化分析
10168個(gè)細(xì)胞降維后根據(jù)T細(xì)胞標(biāo)記基因鑒定出10個(gè)T細(xì)胞亞群（圖4a、b），大多數(shù)幼稚樣細(xì)胞來源于淋巴結(jié)組織，而其余細(xì)胞群似乎在原發(fā)瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位中地位相同（圖4b）。然后作者將3387個(gè)CD8+ T細(xì)胞降維聚類后，基于典型標(biāo)記標(biāo)記為幼稚、過渡、組織駐留記憶、功能失調(diào)前、增殖和晚期功能失調(diào)6個(gè)亞群（圖4c、d）。將CXCL13-high、LAYN 高衰竭/衰老群體作為終點(diǎn)后使用Slingshot確定了兩個(gè)軌跡（圖4e），軌跡1呈現(xiàn)幼稚標(biāo)記物逐漸丟失、功能失調(diào)（和衰老）標(biāo)記物逐漸增加以及中間的增殖“爆發(fā)”，可能反映了腫瘤靶向CD8+細(xì)胞克隆的擴(kuò)大；而組織駐留記憶細(xì)胞(TRM)到功能失調(diào)細(xì)胞的軌跡（軌跡2）則顯示，較少的基因被激活，包括組織駐留(ITGAE)、功能失調(diào)(CTLA4)和顆粒酶(GZM)基因的表達(dá)水平被上調(diào)（圖4b）。Geneswitches算法鑒定了軌跡1中關(guān)鍵基因表達(dá)的改變和對(duì)應(yīng)的TFs（圖4g），作者總結(jié)到主要節(jié)點(diǎn)是早期KLF2丟失、中期NKG7增加和晚期SOX4、DUSP4和RBPJ增加（圖g、h）。
圖4
結(jié)果五、調(diào)節(jié)基因驅(qū)動(dòng)腫瘤靶向細(xì)胞功能障礙/耗竭
SOX4、DUSP4和RBPJ的表達(dá)似乎與功能障礙和耗竭的轉(zhuǎn)變一致，作者接下來通過兩個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。重新分析Puram的研究數(shù)據(jù)顯示功能失調(diào)的CD8細(xì)胞群中SOX4和RBPJ的表達(dá)水平更高，而DUSP4表達(dá)更普遍（圖5a）；皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者在PD1阻斷治療前后獲得的T細(xì)胞的scRNAseq發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因在耗盡的CD8亞群中均表現(xiàn)出更高的表達(dá)（圖5b），不過在PD1阻斷后亞群中SOX4和DUSP4的表達(dá)水平降低（圖5c）。然后作者通過RNAi敲低活化PBMC中SOX4和DUSP4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SOX4敲低導(dǎo)致衰老的CD57+以及功能失調(diào)的PD1+和 CD39+群體減少（圖5d），而對(duì)HNSCC原發(fā)瘤中浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）培養(yǎng)物敲低SOX4后，降低了PD1+和CD8+細(xì)胞的豐度，但對(duì)CD57+細(xì)胞沒有影響。此外，SOX4敲低還導(dǎo)致PD1+CD39+CD8+ TIL亞群減少（圖5e）。這不但驗(yàn)證了CD8+ T細(xì)胞軌跡的功能變化，而且表明SOX4可以作為調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能障礙/耗竭標(biāo)記物表達(dá)的潛在調(diào)節(jié)劑。
圖5
結(jié)果六、使用單細(xì)胞T細(xì)胞受體測序在CD8+ T細(xì)胞中建立克隆結(jié)構(gòu)
TCR分析獲得的克隆標(biāo)識(shí)符可以闡明CDR3序列并提供獨(dú)特的數(shù)據(jù)集來推斷T細(xì)胞的譜系結(jié)構(gòu)。作者對(duì)CD8+ T細(xì)胞中鑒定的1590個(gè)獨(dú)特的TCR序列進(jìn)行分析，GLIPH算法顯示出患者之間的極小的共享，不過在17.39%的CD8+細(xì)胞中觀察到克隆擴(kuò)增，克隆大小范圍為每個(gè)克隆2到60個(gè)細(xì)胞（圖5f）。此外，七名患者中的六名發(fā)現(xiàn)每個(gè)腫瘤（原發(fā)瘤和淋巴結(jié)）的兩個(gè)不同位點(diǎn)之間的克隆重疊。而且在功能失調(diào)的梯度上克隆性逐漸增加，單個(gè)幼稚或TRM衍生的克隆隨后被啟動(dòng)和激活以產(chǎn)生跨越這些軌跡的多個(gè)功能失調(diào)的克隆（圖5g、h）
結(jié)果七、結(jié)前細(xì)胞和免疫微環(huán)境
前面分析確定了原發(fā)瘤的結(jié)前亞群具有侵襲和遷移的內(nèi)在特性，但是轉(zhuǎn)移也需要獲得免疫逃逸表型，所以作者通過CellChat分析結(jié)前細(xì)胞是否特定的免疫調(diào)節(jié)表型，發(fā)現(xiàn)結(jié)前細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞互作增加（圖6a），而且腫瘤細(xì)胞分泌的Midkine（MDK）與CD8+ T細(xì)胞上的MDK受體的相互作用似乎是復(fù)發(fā)性免疫抑制途徑（圖6b）。
使用MDK抑制劑處理癌細(xì)胞懸液，與對(duì)照組相比，MDK抑制劑處理后非T細(xì)胞豐度下降，而CD8+ T細(xì)胞百分比則有所增加，而且HN370和HN380中癌細(xì)胞（panCK+）和增殖性癌細(xì)胞（ki67+）的豐度也降低（圖6c），說明MDK信號(hào)可以抑制CD8介導(dǎo)抗腫瘤活性。接下來，作者用HN279腫瘤培養(yǎng)物的結(jié)前細(xì)胞構(gòu)建人源化小鼠模型來研究了MDK驅(qū)動(dòng)免疫抑制是否會(huì)受到抑制免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）療法的治療，發(fā)現(xiàn)抗PD1治療后，腫瘤略有減小。通過單細(xì)胞RNA-seq發(fā)現(xiàn)大多數(shù)處理后的癌細(xì)胞表達(dá)MDK（圖6d）和許多不受ICB影響的與結(jié)前表型相關(guān)的基因（SNAI2、AXL、STAT2），不過AURKB和TOP2A（細(xì)胞周期基因）的表達(dá)顯著下調(diào)（圖6e），表明癌細(xì)胞增殖減少。
與未經(jīng)治療的小鼠相比，接受pembrolizumab（治療癌癥的藥物）治療的小鼠的CD8+細(xì)胞表現(xiàn)出幼稚、功能失調(diào)和記憶減少，同時(shí)增殖性、細(xì)胞毒性/旁觀者、組織駐留亞群增加（圖6f、g），而表達(dá)MDK受體的CD8細(xì)胞的分析顯示出相反的趨勢(shì)，功能障礙的增加和增殖（腫瘤靶向）群體的減少（圖6h），表明MDK信號(hào)通過PD1阻斷劑消除重新激活促進(jìn)免疫抑制。此外，這些變化也與NFKB1激活相關(guān)（圖6i、j）。最后，作者總結(jié)MDK信號(hào)通路是結(jié)前細(xì)胞逃避CD8介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的途徑。
圖6
小結(jié)：
學(xué)習(xí)完這篇文章，小編為作者清晰的條理和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪壿嫸鴩@服，也發(fā)現(xiàn)了很多亮點(diǎn)：
腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸一直是生信研究的熱點(diǎn)，如何推陳出新也是大家思考的重點(diǎn)。我想這篇文章應(yīng)該可以給你一些啟發(fā)！
