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哈嘍，各位同學(xué)大家好~好久不見(jiàn)，分外想念呢。最近總有做實(shí)驗(yàn)的同學(xué)問(wèn)我，為什么你們做生信的如此高產(chǎn)，5分文章輕輕松松，10分文章努力一下子也不是沒(méi)有可能？ 咋說(shuō)呢，可能還是因?yàn)槲覀兌鄷?huì)了那么一點(diǎn)點(diǎn)生物信息學(xué)分析方法。生信文章的基礎(chǔ)在于數(shù)據(jù)，那些在實(shí)驗(yàn)室不分晝夜、勤勤懇懇做實(shí)驗(yàn)以獲取原始數(shù)據(jù)的同學(xué)是非常非常重要的。在得到原始數(shù)據(jù)后，我們要做的便是對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲取數(shù)據(jù)中的差異部分，并尋求這些差異與疾病機(jī)制，功能上的聯(lián)系。生物信息入門很簡(jiǎn)單，但對(duì)那些純做實(shí)驗(yàn)的同學(xué)的幫助卻遠(yuǎn)不止一點(diǎn)點(diǎn)。比如前段時(shí)間，我們相繼推出乳酸，焦亡，免疫，鐵死亡等多個(gè)專題討論，這些基因吸引了不少實(shí)驗(yàn)同學(xué)的目光，卻也有很多同學(xué)不知道在自己想要研究的細(xì)胞中，癌型里該從哪個(gè)角度入手，哪組基因去做。除查閱文獻(xiàn)等常規(guī)操作外，生物信息完全可以幫你做好前期篩選，甚至幫你確定整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程。至于具體怎么做呢，還不趕緊和我一起開(kāi)始今天的學(xué)習(xí)。下面，小編將從lncRNA，mRNA，miRNA，蛋白質(zhì)組學(xué)等幾個(gè)具體實(shí)例來(lái)幫助大家更好的理解生物信息在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮的巨大作用。
角度一：基于差異表達(dá)分析鎖定疾病進(jìn)程中的關(guān)鍵LncRNA，進(jìn)一步通過(guò)分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，通路富集分析等常用生物信息學(xué)分析方法確定與LncRNA相關(guān)的調(diào)節(jié)因子以及其生物學(xué)功能，并最終通過(guò)實(shí)驗(yàn)，分別從目標(biāo)LncRNA的過(guò)表達(dá)和沉默兩方面對(duì)LncRNA的功能以及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。
LncRNA CTD-2528L19.6 prevents the progression of IPF by alleviating fibroblast activation
LncRNA CTD-2528L19.6通過(guò)減輕成纖維細(xì)胞激活阻止IPF進(jìn)展
（Cell Death and Disease，8.4685）
該研究首先基于差異表達(dá)分析識(shí)別IPF（特發(fā)性肺纖維化）致病性LncRNA和IPF進(jìn)展型LncRNA，并構(gòu)建IPF致病和進(jìn)展LncRNA- mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵LncRNA CTD-2528L19.6，該lncRNA通過(guò)介導(dǎo)纖維化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控成纖維細(xì)胞在IPF進(jìn)展中的激活。研究者進(jìn)一步基于實(shí)驗(yàn)證明沉默CTD-2528L19.6可在mRNA和蛋白水平上增加Fn1和Collagen I的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，加速M(fèi)RC-5細(xì)胞的遷移和增殖，而CTD-2528L19.6過(guò)表達(dá)則可減輕TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞成纖維細(xì)胞的激活，以及LncRNA CTD-2528L19.6可以通過(guò)調(diào)節(jié)LRRC8C的表達(dá)抑制成纖維細(xì)胞的激活。
IPF致病特征和IPF進(jìn)展特征的識(shí)別（圖1）：基于生物信息學(xué)方法分別識(shí)別(1)早期IPFvs正常IPF;(2)晚期IPF vs正常;(3)晚期IPF vs早期IPF三類情況下的差異表達(dá)mRNA和LncRNA。其中，兩個(gè)LncRNA和48個(gè)mRNA在三種比較中均檢測(cè)到顯著差異表達(dá)。有趣的是與正常樣本相比，LncRNA CTD-2528L19.6、NR2F1-AS1在早期IPF患者中顯著上調(diào)，然而相較于早期IPF患者而言，在晚期IPF中又發(fā)生顯著下調(diào)，并且在晚期IPF中的表達(dá)水平仍高于正常肺組織。DCLRE1C、S100A8、THBS1等基因在正常、早期和晚期IPF中表現(xiàn)出表達(dá)逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)。與正常樣本相比，在早期和晚期IPF中存在差異表達(dá)的43個(gè)差異LncRNA和835個(gè)差異mRNA被定義為IPF致病特征。與正常和早期樣本相比，在晚期IPF中發(fā)生差異表達(dá)的14個(gè)差異lncRNAs和264個(gè)差異 mRNA被定義為IPF進(jìn)展特征。研究者發(fā)現(xiàn)所有IPF進(jìn)展相關(guān)lncRNAs在正常肺向早期IPF過(guò)渡過(guò)程中均急劇上調(diào)，并有反彈趨勢(shì)。IPF進(jìn)展相關(guān)lncRNAs的表達(dá)在向晚期IPF過(guò)渡過(guò)程中明顯下調(diào)，但仍高于正常肺。IPF進(jìn)展相關(guān)mRNA中也觀察到類似的反彈趨勢(shì)。
圖1. IPF致病特征和IPF進(jìn)展特征的識(shí)別
構(gòu)建IPF致病相關(guān)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖2）：為捕獲IPF發(fā)病機(jī)制的核心lncRNA-mRNA調(diào)控模塊，研究者構(gòu)建IPF致病相關(guān)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。致病共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)以CTD-2528L19.6為核心的子網(wǎng)絡(luò)。IPF致病網(wǎng)絡(luò)中上調(diào)的mRNA參與原發(fā)性免疫缺陷、軸突引導(dǎo)和T細(xì)胞受體信號(hào)通路，下調(diào)的mRNA則主要參與癌癥和癌癥相關(guān)信號(hào)通路。
圖2.構(gòu)建IPF致病相關(guān)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
構(gòu)建動(dòng)態(tài)IPF進(jìn)展lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)：為探索IPF進(jìn)展的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制，研究者分別構(gòu)建IPF早期特異性lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和晚期特異性lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。在IPF早期特定網(wǎng)絡(luò)中，CTD-2528L19.6與 15個(gè)mRNA存在共表達(dá)。在IPF晚期特定網(wǎng)絡(luò)中，CTD- 2528L19.6與6個(gè)mRNA存在共表達(dá)（圖3）。在兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中與CTD-2528L19.6相關(guān)的LRRC8C已被證實(shí)為IPF生物標(biāo)志物，并有多個(gè)與CTD-2528L19.6表達(dá)相關(guān)的基因?qū)儆诶w維化相關(guān)基因 (圖4)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)CTD-2528L19.6和LRRC8C在IPF動(dòng)態(tài)進(jìn)展中的調(diào)控關(guān)系。
圖3. IPF早期和晚期的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
圖4. IPF進(jìn)展中與lncRNA共表達(dá)的mRNA屬于纖維化相關(guān)基因
CTD-2528L19.6與成纖維細(xì)胞基因表達(dá)負(fù)相關(guān)：為探討CTD-2528L19.6與纖維化的關(guān)系，研究者對(duì)CTD-2528L19.6與6個(gè)IPF細(xì)胞特征基因進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)CTD-2528L19.6與6個(gè)IPF細(xì)胞特征基因表達(dá)負(fù)相關(guān)（圖5）。
圖5. CTD-2528L19.6與成纖維細(xì)胞基因表達(dá)負(fù)相關(guān)
沉默CTD-2528L19.6可促進(jìn)MRC-5細(xì)胞成纖維細(xì)胞的活化：鎖定CTD-2528L19.6，并在細(xì)胞系水平上探究其在MRC-5細(xì)胞成纖維細(xì)胞活化中的作用（圖6）。
圖6. 沉默CTD-2528L19.6可促進(jìn)MRC-5細(xì)胞成纖維細(xì)胞的活化
CTD-2528L19.6過(guò)表達(dá)可減輕TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的活化：沉默做完，做激活，不出意料成纖維細(xì)胞活化程度被大大減輕。
圖7. CTD-2528L19.6過(guò)表達(dá)可減輕TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的活化
沉默LRRC8C可減輕CTD- 2528L19.6對(duì)成纖維細(xì)胞活化的抑制作用：在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，CTD- 2528L19.6表達(dá)與LRRC8C在早期和晚期IPF均呈正相關(guān)，因此進(jìn)一步沉默LRRC8C，探究其在CTD- 2528L19.6對(duì)成纖維細(xì)胞活化過(guò)程中的作用（圖8）。
圖8. CTD-2528L19.6在MRC-5細(xì)胞中調(diào)控LRRC8C
角度二：基于差異表達(dá)分析，預(yù)后分析，靶基因調(diào)控分析等傳統(tǒng)生物信息學(xué)方法識(shí)別候選miRNA，并進(jìn)一步基于細(xì)胞系水平和小鼠水平實(shí)驗(yàn)評(píng)估候選miRNA在抑制癌癥進(jìn)展方面的治療潛力。
Systematic identification of clinically relevant miRNAs for potential miRNA-based therapy in lung adenocarcinoma
系統(tǒng)識(shí)別臨床相關(guān)的miRNAs用于潛在的基于miRNA的肺腺癌治療
（Mol Ther Nucleic Acids，8.8865）
該工作對(duì)TCGA的microRNA測(cè)序和RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)整合分析，以確定臨床相關(guān)的腫瘤抑制microRNA。根據(jù)差異表達(dá)、生存顯著性水平、與靶基因的相關(guān)性和對(duì)生存的累加效應(yīng)，研究者最終確定三個(gè)候選miRNAs (miR-195- 5p、miR-101-3p和miR-338-5p)，并進(jìn)一步基于實(shí)驗(yàn)評(píng)估這些miRNAs在抑制癌癥進(jìn)展方面的治療潛力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不僅單一miRNA模擬物的藥物處理有利于抑制腫瘤生長(zhǎng)，三種miRNA模擬物的聯(lián)合使用更能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展。
通過(guò)生物信息學(xué)方法識(shí)別候選miRNA（圖1）：基于差異表達(dá)分析和預(yù)后分析對(duì)miRNA進(jìn)行過(guò)濾，最終得到五個(gè)候選miRNA（miR-195-5p、miR-30a-5p、miR-30d-5p、miR-101-3p、和miR-338-5p）。并進(jìn)一步確定這些候選miRNA調(diào)控的靶基因，發(fā)現(xiàn)有349個(gè)具有預(yù)后意義，且在正常-疾病中發(fā)生差異表達(dá)的基因與候選miRNAs表達(dá)高度相關(guān)?；趍iRTarbase中miRNA-靶基因預(yù)測(cè)關(guān)系對(duì)這些靶基因進(jìn)一步過(guò)濾，最終得到47個(gè)靶基因。候選miRNAs在miRNAs-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控多個(gè)重要靶點(diǎn)，表明這些miRNAs在癌癥發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖1. 通過(guò)生物信息學(xué)方法識(shí)別候選miRNAs
進(jìn)一步對(duì)miRNA數(shù)量進(jìn)行增加組合，并基于生存分析，探究miRNA在降低LUAD患者風(fēng)險(xiǎn)方面是否存在加成效應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)納入更多候選miRNA時(shí)，不同miRNA組合的HR值逐漸下降，表明不同miRNA之間存在累加效應(yīng)。因此，研究者選擇使HR達(dá)到最低的組合（miR-195-5p、miR-101-3p和miR-338-5p）作進(jìn)一步分析，生存分析表明三個(gè)miRNA都高表達(dá)的患者比三個(gè)miRNA都低表達(dá)的患者預(yù)后更好，表明三個(gè)miRNAs共同高表達(dá)與LUAD患者預(yù)后較好有關(guān)（圖2）。
圖2. 候選miRNA的累加生存分析
體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證3個(gè)腫瘤抑制相關(guān)候選miRNA：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-195-5p、miR-101-3p或miR-338-5p可降低A549、Bm7和Hop62細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展水平（圖3）。
圖3：候選miRNA單獨(dú)過(guò)表達(dá)可降低A549、Bm7和Hop62細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展水平
聯(lián)合過(guò)表達(dá)候選miRNA抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移：為證實(shí)候選miRNA的有效性，研究者進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。由于miRNA組合的有效性大于任何單個(gè)miRNA，因此研究者在小鼠實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步對(duì)三種miRNA組合進(jìn)行評(píng)估。研究者將對(duì)照或三個(gè)miRNAs組合過(guò)表達(dá)的Bm7人肺癌細(xì)胞通過(guò)皮下注射到裸鼠體內(nèi)，并監(jiān)測(cè)產(chǎn)生的腫瘤的大小。結(jié)果表明，聯(lián)合過(guò)表達(dá)候選miRNA抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（圖4）。
圖4. 聯(lián)合過(guò)表達(dá)候選miRNA抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
角度三：蛋白質(zhì)組學(xué)+RNA測(cè)序基礎(chǔ)結(jié)合生物信息學(xué)分析確定耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)，藥物抑制和蛋白靶向?qū)嶒?yàn)協(xié)同驗(yàn)證免疫調(diào)節(jié)藥物耐藥機(jī)制。
Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma
蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示CDK6上調(diào)是多發(fā)性骨髓瘤來(lái)那度胺的靶向耐藥機(jī)制
（NATURE COMMUNICATIONS，14.9196）
免疫調(diào)節(jié)藥物(IMiDs)來(lái)那度胺和波馬度胺是治療多發(fā)性骨髓瘤的有效藥物。然而，幾乎所有患者最終都因獲得性耐藥而復(fù)發(fā)，但僅在小部分病例中發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)的基因改變。為確定耐藥的非遺傳機(jī)制，研究者對(duì)來(lái)自多發(fā)性骨髓瘤患者的5個(gè)配對(duì)治療前和復(fù)發(fā)樣本進(jìn)行RNA測(cè)序以及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。生物信息學(xué)分析揭示CDK6控制的蛋白質(zhì)耐藥特征，包括骨髓瘤高危因子如TRIP13和RRM1等。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明在多種骨髓瘤細(xì)胞株中，CDK6的過(guò)表達(dá)降低對(duì)IMiDs的敏感性，而palbociclib抑制CDK6或蛋白水解靶向嵌合體(PROTACs)降解CDK6與IMiDs具有高度的體內(nèi)外協(xié)同作用。該工作認(rèn)為CDK6上調(diào)可以作為IMiDs耐藥多發(fā)性骨髓瘤的藥物靶點(diǎn)。
定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析識(shí)別復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤中失調(diào)蛋白質(zhì)：生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與治療前相比，復(fù)發(fā)組有130個(gè)蛋白上調(diào)，228個(gè)蛋白下調(diào)。上調(diào)程度最高的蛋白包括TRIP13、RRM1、NCAPD2、NCAPH、MORF4L1和CDK6，而下調(diào)最多的包括UPRT、DNAJC1、FCRL2、AUH、HYI和HID1。蛋白質(zhì)免疫印跡分析進(jìn)一步表明與原發(fā)樣本相比，CDK6，TRIP13,，RRM1蛋白在復(fù)發(fā)樣本中被更頻繁的檢測(cè)到。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明短期使用來(lái)那度胺或蛋白酶體抑制劑72小時(shí)，對(duì)CDK6蛋白沒(méi)有影響，甚至降低CDK6的蛋白水平，表明藥物并沒(méi)有直接誘導(dǎo)CDK6的表達(dá)上升從而導(dǎo)致耐藥（圖2）。
圖1. 復(fù)發(fā)性多發(fā)骨髓瘤患者中CDK6蛋白上調(diào)
CDK6過(guò)表達(dá)增強(qiáng)IMiDs耐藥：細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)表明CDK6過(guò)表達(dá)會(huì)降低IMiDs的敏感性。
圖2. CDK6過(guò)表達(dá)會(huì)降低IMiDs的敏感性
palbociclib抑制CDK6與IMiDs協(xié)同治療多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞：Palbociclib在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中沒(méi)有中度活性。然而，palbociclib顯著增強(qiáng)IMiDs的抗多發(fā)性骨髓瘤作用。在CDK6蛋白水平升高以及CDK6過(guò)表達(dá)細(xì)胞的獲得性來(lái)那度胺耐藥細(xì)胞中，palbociclib的加入恢復(fù)與親代細(xì)胞相似的IMiDs敏感性水平，表明palbociclib治療增加多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)來(lái)那度胺的敏感性（圖3）。
圖3. palbociclib與IMiD協(xié)同治療多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞
蛋白水解靶向嵌合體(PROTACs)降解CDK6與IMiDs具有高度的體內(nèi)外協(xié)同作用（圖4）：蛋白水解靶向嵌合體(PROTACs)降解CDK6與 palbociclib抑制CDK6具有相似作用。
圖4. CDK6抑制與IKZF1/3降解協(xié)同作用
pomalidomide與palbociclib聯(lián)合治療多發(fā)性骨髓瘤的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pomalidomide與palbociclib聯(lián)合治療在體外同樣有效，palbociclib抑制CDK6可以增強(qiáng)小鼠對(duì)pomalidomide的敏感性（圖5）。
圖5：pomalidomide與palbociclib聯(lián)合治療的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
靶向骨髓瘤細(xì)胞中的CDK6可以逆轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)蛋白特征：細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)表明在復(fù)發(fā)相關(guān)的細(xì)胞系中，復(fù)發(fā)相關(guān)蛋白的特征在CDK6被抑制后發(fā)生逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步推測(cè)CDK6抑制通過(guò)逆轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)相關(guān)蛋白表達(dá)特征恢復(fù)免疫治療的敏感性。
圖6：靶向骨髓瘤細(xì)胞中的CDK6可以逆轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)蛋白特征
小結(jié)：
相信看完今天的分享小伙伴們一定對(duì)生物信息在實(shí)驗(yàn)中的作用有了初步的理解和大概的掌握，最后就讓我們來(lái)總結(jié)下生物信息在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用以及論證生物信息結(jié)論的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)吧！
生物信息在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用：
（1）確定研究對(duì)象：通過(guò)生物信息學(xué)分析鎖定在疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的因子，進(jìn)而有助于課題的確定與開(kāi)展。
（2）推動(dòng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程：在實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定后，進(jìn)一步基于生物信息學(xué)分析識(shí)別與目標(biāo)基因、蛋白質(zhì)等相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，有助于機(jī)制分析和實(shí)驗(yàn)后續(xù)開(kāi)展。
（3）補(bǔ)充完善實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)完成的基礎(chǔ)上，同樣可以反推到組織，藥效等公開(kāi)數(shù)據(jù)中進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
論證生物信息結(jié)論的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)：
（1）鎖定目標(biāo)蛋白/mRNA/lncRNA后，分別通過(guò)抑制/過(guò)表達(dá)/藥物靶向抑制等多個(gè)角度驗(yàn)證特征因子在疾病進(jìn)展或其他藥物響應(yīng)中的作用。
（2）通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)因子改變后，其他蛋白/mRNA/lncRNA等變化驗(yàn)證生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)機(jī)制。
（3）在抑制/過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中，對(duì)特征因子進(jìn)行重塑，恢復(fù)其功能后進(jìn)一步驗(yàn)證特征因子功能。
好啦，今天的內(nèi)容就是這些，希望咱們做生信的同學(xué)能和實(shí)驗(yàn)室的小伙伴們多多交流，互通有無(wú)，成為彼此的“驕傲”和“依靠”吧！你中有我，我中有你，還怕高分文章遲遲不來(lái)嗎~
參考文獻(xiàn)：
1. LncRNA CTD-2528L19.6 prevents the progression of IPF by alleviating fibroblast activation
2. Systematic identification of clinically relevant miRNAs for potential miRNA-based therapy in lung adenocarcinoma
3. Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma
