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胰腺癌是最具破壞性的癌癥之一，胰腺癌的進展是由多個激活通路和表觀遺傳水平上的串?dāng)_事件引起的。RNA修飾作為一種可逆的表觀遺傳機制，在包括腫瘤發(fā)生在內(nèi)的幾乎所有重要生物過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。今天小編就帶大家閱讀一篇2022年12月19日，發(fā)表在Frontiers in Immunology（IF:8.786）的文章，看看作者是如何從RNA修飾出發(fā)進行探索的吧！
Interplay of four types of RNA modification writers revealed distinct tumor microenvironment and biological characteristics in pancreatic cancer
四種類型的RNA修飾writers的相互作用揭示了胰腺癌中不同的腫瘤微環(huán)境和生物學(xué)特征
文章概述
胰腺癌(PC)是最致命的惡性腫瘤之一。四種類型的RNA修飾（即M6A、M1A、APA和A-to-I）可以被不同的酶化合物（“writers”）催化，介導(dǎo)許多癌變和免疫調(diào)節(jié)的表觀遺傳事件。 作者首先在TCGA中獲得26個RNA修飾writers的特異表達模式和轉(zhuǎn)錄變異。進行無監(jiān)督共識聚類，將患者分為兩個RNA修飾聚類(WM_score_high和_low）。在此基礎(chǔ)上，建立了基于差異表達基因的RNA修飾評分模型，并在ICGC數(shù)據(jù)集上進行了驗證。WM_score_high亞組與較差的預(yù)后、Th2/Th17細胞極化和致癌通路（如EMT、TGF-B和mTORC1信號通路）相關(guān)，而WM_score_low亞組與良好的生存率和Th1細胞趨勢相關(guān)。WM_Score模型在解釋轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后事件方面也證明了穩(wěn)健的預(yù)測能力。WM_score模型在表觀遺傳學(xué)、免疫學(xué)和生物學(xué)方面具有較強的預(yù)測能力，為今后臨床判斷PC提供了理論依據(jù)。
主要結(jié)果
PC中四種RNA修飾writers的轉(zhuǎn)錄變異
作者從目前已發(fā)表文獻中篩選了26個RNA修飾writers（7個m6A writers、4個m1A writers、12個APA writers和3個A-I writers）。 為了探索PC中四種類型的RNA修飾writers的潛在轉(zhuǎn)錄變異，統(tǒng)計了26個writers中非同義體細胞突變的頻率。 如圖1A所示，821個樣本中71個存在RNA修飾writers的突變。其中，PCF11突變頻率最高，CPSF1、ADARB2、WTAP和RBM15次之。盡管這些writers的不同突變狀態(tài)之間的總體生存率之間的比較不顯著，但具有突變的PC患者的生存率低于無突變的患者，這意味著轉(zhuǎn)錄改變可能在PC的進展中起著至關(guān)重要的作用。作者還評估了這些writers的體細胞CNV。有趣的是，ADAR、CPSF1、TRMT61B、CPSF4和CSTF1具有廣泛的CNV擴增，而WTAP、ADARB1、RBM15、RBM15B和CF1具有較少的CNV擴增（圖1B）。為了進一步了解這26個RNA修飾writers的表達與轉(zhuǎn)錄變異狀態(tài)之間的關(guān)系，作者比較了這些writers在配對的正常組織和PC組織中的mRNA表達，大多數(shù)writers在PC組織中高表達（圖1C- F）。那些具有CNV擴增的writers在PC組織中顯著高表達，反之亦然。這表明CNV可能是這些writers轉(zhuǎn)錄過程中的一個關(guān)鍵因素。盡管如此，一些writers表達廣泛，但CNV缺失。因此，為了檢查PC中CNV和mRNA表達之間的差異，作者集中研究了不同writers中CNV狀態(tài)的亞組，這些writers在超過20%的樣本中擁有CNV缺失。在CPSF2、ADAR 和 TRMT61A 中，CNV擴增的PC患者的mRNA表達高于CNV缺失的患者。所有這些分析確定了26個RNA 修飾writers的轉(zhuǎn)錄場景和mRNA表達之間的聯(lián)系。
TIME和癌癥標(biāo)志與RNA修飾writers的模式相關(guān)
為了探究這些RNA修飾writers之間的相互關(guān)系，計算了它們之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)除了TRMT61A之外，大多數(shù)相關(guān)性都是正相關(guān)的。此外，單因素Cox分析顯示26個writers中10個writers是PC患者的獨立預(yù)后因素。因此，這些檢測使作者確認某些串?dāng)_關(guān)系可能存在于特定的RNA修飾簇中。然后，根據(jù)上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，進行無監(jiān)督共識聚類，根據(jù)22個選定的RNA修飾writers的表達矩陣，將PC患者分為Writer_cluster_1和Writer_cluster_2（圖2A-E）。值得注意的是，Writer_cluster_1的特點是APA writers（CPSF1, CPSF4, PABPN1）的高表達，而m6A writers（METLL14, ZC3H13, VIRMA）的過度表達總是發(fā)生在Writer_cluster_2；此外，METTL3在Writer_cluster_1中被上調(diào)，證實了PC的獨特m6A調(diào)節(jié)模式（圖2E）。然后，GSVA分析被用于研究兩個不同的RNA修飾簇的分子和生物學(xué)功能。Writer_cluster_1在DNA修復(fù)、堿基切除修復(fù)和RNA聚合中明顯富集，而Writer_cluster_2在腫瘤發(fā)生和免疫反應(yīng)時期明顯富集，如EMT、JAK/STAT信號通路和趨化因子信號通路（圖2F）。分別以O(shè)S、DFI、PFI和DSS作為事件的終點，發(fā)現(xiàn)，RNA修飾的Writer_cluster_2模式表現(xiàn)出比Writer_cluster_1模式更優(yōu)的生存率（圖2G-J）。在研究中仍然考慮了不同RNA修飾模式的時間。CIBERSORT算法被用來衡量兩種不同的RNA修飾模式之間的組成差異。在大體上，26種RNA修飾writers的表達情況與腫瘤免疫浸潤高度相關(guān)。兩種模式中22種免疫細胞的豐度也被量化（圖2K）。RNA修飾的Writer_clsuter_1模式擁有較高的免疫抑制細胞（如T細胞調(diào)節(jié)）的浸潤，這與圖2G-J中的不良預(yù)后相一致。
構(gòu)建和驗證RNA修飾writers的signature
為了進一步研究兩種不同的RNA修飾模式的生物學(xué)機制，作者進行了差異分析，確定了215個與不同RNA修飾狀態(tài)相關(guān)的DEGs。并進行富集分析，為了驗證調(diào)控的異質(zhì)性，根據(jù)這些DEGs應(yīng)用無監(jiān)督共識聚類，將PC患者分為DEG_cluster_A和DEG_cluster_B。與RNA修飾writers的聚類一致，大多數(shù)聚類在Writer_cluster_1的患者對應(yīng)于DEG_cluster_A，而Writer_cluster_2對應(yīng)于DEG_cluster_B。TCGA隊列中的患者按7:3的比例被隨機分配到訓(xùn)練和測試組。根據(jù)DEGs，進行單變量Cox回歸以減少冗余，剩下38個預(yù)后相關(guān)的DEGs。接下來，使用LASSO-Cox算法來區(qū)分TCGA訓(xùn)練集中的兩種RNA修飾模式（圖3A）。最后，建立了一個基于10個DEGs的模型，名為WM_Score模型，并根據(jù)WM_Score的中位數(shù)將PC患者分為WM_Score_高（WM_high）和WM_Score_低（WM_low）組。通過ROC曲線評估WM_Score模型對總生存期的預(yù)測能力，在TCGA訓(xùn)練集中AUC達到0.722，2年為0.743，3年為0.756，并在TCGA測試集中得到有力驗證（圖3B，C）。巧合的是，這三個分型（Writer_cluster_1/2、DEG_cluster_A/B和WM_Score_high/low）通過不同的計算策略表現(xiàn)出高度的一致性（圖3D）。WM_cluster_2比WM_cluster_1有更高的WM_Score。同樣的道理，DEG_cluster_B的WM_core比DEG_cluster_A高（圖3E，F(xiàn)）。隨后，比較了WM_Score_高組和WM_Score_低組的預(yù)后和臨床病理特征。與WM_Score_高組的患者相比，WM_Score_低組的患者表現(xiàn)出較好的生存率（圖3G-J）。多變量Cox分析顯示，WM_Score與預(yù)后有明顯的對應(yīng)關(guān)系，而年齡、性別、分期、分級和腫瘤大小不相關(guān)（圖3K）。為了進一步驗證WM_Score模型的可靠性和實用性，使用ICGC和GEO數(shù)據(jù)集進行外部驗證（圖3L，M）。
WM_Score模型與分子生物學(xué)特征的交互作用
為了探索上述不同的WM_Score亞組的功能作用，進行GSVA分析。發(fā)現(xiàn)WM_Score_高組在EMT、TGF-b和mTORC1信號通路上富集（圖4A）。為了研究與EMT通路的相關(guān)性，根據(jù)上皮和間質(zhì)標(biāo)記基因的表達計算了EMT評分。間質(zhì)化趨勢越強，WM_Score越高，這可能解釋了WM_Score_高組的生存率較差（圖4B）。從已發(fā)表的數(shù)據(jù)來看，PC可以分為三種轉(zhuǎn)錄組分類的分子亞型（MS），包括Moffitt分類、Collisson分類和Bailey分類。根據(jù)文獻中這三種MS分類的標(biāo)志性基因特征，進行了無監(jiān)督的共識聚類，將PC患者分為不同的MS。為了評估MS和WM_Score之間的關(guān)系，分析了TCGA數(shù)據(jù)集中MS的WM_Score。在所有9種MS中，基底樣、QM-PDA和鱗狀亞型的WM_Score相對較高，這可能與它們的不利預(yù)后有關(guān)（圖4C-E）。作者還對這三種分類進行了重疊分析，通過直方圖的分布進行了可視化。一致的是，惡性MS程度高的患者（如基底樣和鱗狀亞型）傾向于被確定為WM_Score_高組，反之亦然（圖4F-H）。此外，晚期PC的WM_Score高于早期等級和階段的PC（圖4I，J），意味著這種WM_Score模型可能對臨床前診斷更敏感。然而，WM_Score在年齡、性別和腫瘤大小之間沒有明顯差異。
與WM_Score相關(guān)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
RNA修飾歷來被認為是轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子，而WM_Score模型則是基于RNA修飾writers進行的。因此，集中研究了與WM_Score有關(guān)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后事件（如APA、m6A和m1A）。APA通過為mRNA提供3'UTR促進轉(zhuǎn)錄的改變，而3'UTR是miRNAs的結(jié)合位點，作者提出兩種RNA修飾狀態(tài)可能有特定的miRNA特征，基于對不同writers的調(diào)控。首先，對WM_Score_hingh組和_low組進行了差異化分析，42個miRNA被篩選出來，并對其靶基因進行了富集分析，確定了8個miRNAs、14個mRNAs和9個富集的通路（圖5A）。作者確定了兩個RNA修飾之間的基因具有不同的PDUI，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)具有負PDUI（縮短3'UTR）的基因富集在WM_Score_high組（圖5B）。通過單變量Cox分析，選擇了5個預(yù)后相關(guān)的基因進行驗證。在WM_Score_high組中，COL1A2的3'UTR明顯延長，而DKK1、AREG和CEACAM5的3'UTR則明顯縮短。對于那些3'UTR延長的基因，延長組的病人比縮短組的病人生存率更差，同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在3'UTR縮短的基因上（圖5C-F）。為了研究WM_Score是否與m6A和m1A有關(guān)，通過RMVar數(shù)據(jù)庫探討了DEGs與m6A或m1A之間的相應(yīng)關(guān)系。WM_Score是一個基于RNA修飾writers的綜合預(yù)測模型（圖5G，H）。
識別針對WM_Score模型的潛在化合物
為了確認WM_Score對藥物敏感性的影響，進行Spearman相關(guān)分析，以計算WM_Score和基于GDSC數(shù)據(jù)集的藥物反應(yīng)之間的關(guān)系指數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)38個潛在的化合物與WM_Score有明顯的關(guān)系。探索這些化合物的靶向通路。結(jié)果顯示，針對WM_Score_低患者的化合物可能調(diào)節(jié)MAPK、DNA復(fù)制和基因組的完整性，以加強其自身的敏感性（圖5I）。綜上所述，WM_Score被證明是一種創(chuàng)新的PC治療目標(biāo)。
WM_Score預(yù)測了獨特的TIME和免疫基因組學(xué)模式
為了研究WM_Score模型的不同TIME，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集中患者的表達譜，應(yīng)用了CIBERSORT和ESTIMATE算法。根據(jù)WM_Score_high組和WM_Score_low組的22種免疫細胞的豐度沒有明顯差異，但WM_score與ESTIMATEScore、ImmnueScore和StromaScore呈正相關(guān)，意味著WM_Score模型中免疫細胞的浸潤高度豐富。為了進一步驗證不同WM_Score亞組之間的免疫細胞浸潤，根據(jù)基因簽名 "LM22 "對28種基質(zhì)和免疫細胞類型進行了ssGSEA，在兩個不同的WM_Score亞組中發(fā)現(xiàn)了多種T細胞浸潤（圖6A）。考慮到PC是一種免疫冷腫瘤，基于WM_Score對PC的免疫基因組模式的探索是迫切需要強調(diào)的。四種類型的T細胞（Th1細胞，Th2細胞，Th17細胞和Treg細胞）參與以下分層分析。從MSigDB數(shù)據(jù)庫中提取BIOCARTA_IL12_PATHAY和BIOCARTA_IL4_PATHWAY作為背景基因集，分別計算基于這兩個基因集的ssGSEA評分。然后，將這兩個ssGSEA分?jǐn)?shù)相減的中值確定為區(qū)分患者與 Th1_trend 和 Th2_trend 的分界點。如圖6B所示，Th2_trend患者的WM_Score 高于Th1_trend患者。另一方面，從PathCards數(shù)據(jù)庫中下載Th17細胞分化基因集，并根據(jù)通過該基因集計算的ssGSEA分?jǐn)?shù)的中值將患者分為Th17_diff_up和 Th17_diff_down 組，發(fā)現(xiàn)Th17_diff_up組中的患者傾向于獲得更高的 WM_Score（圖 6C）。為了進一步證實 WM_Score 中T細胞浸潤的機制，從已發(fā)表的文獻中篩選了這四種類型 T 細胞的幾種細胞因子標(biāo)志物，并比較了它們在不同 WM_Score 亞組之間的表達模式。從整體來看，WM_Score_high 組聚集了更豐富的這些 T 細胞浸潤（圖6D-G）。
總結(jié)
文章到這里就要結(jié)束了，是不是意猶未盡呢！文章從RNA修飾出發(fā)，利用多組學(xué)數(shù)據(jù)進行挖掘，邏輯清晰，層層遞進，是一篇非常值得借鑒的文章。純生信發(fā)文越來越難，但是，只要找好角度，設(shè)計好思路一樣可以發(fā)文章，看完這篇文章的你，心動了嗎？
