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大家好呀，今天小編給大家?guī)肀驹聞倓偘l(fā)表在Cancer Discovery上的一篇單細(xì)胞的文章——Natural coevolution of tumor and immunoenvironment in glioblastoma（IF:38.272）作者一共整合了306,324個(gè)多灶性GBM單細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，來研究原發(fā)性GBMs自然進(jìn)化過程中腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的關(guān)系。
4例多灶性GBMs的患者(即NJ01、NJ02、TT01和TT02)(每個(gè)病例有2個(gè)原發(fā)性IDH野生型病變)，對(duì)這些樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序(NJ01: 21,518個(gè)細(xì)胞;NJ02: 21715;TT01: 10767個(gè)細(xì)胞;TT02: 7062細(xì)胞)，如下圖所示。
IDH野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是成年人最常見和最具侵襲性的腦瘤類型。由于腫瘤惡性程度的演變，改善GBM的預(yù)后仍然具有挑戰(zhàn)性。標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理，去腫瘤手術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺，中位生存期約15個(gè)月。大多數(shù)患者在初次治療后十個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)。由于GBM中存在顯著的免疫抑制的微環(huán)境， ICIs并沒有給GBM患者帶來實(shí)質(zhì)性的臨床益處。腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的通訊在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。因此，系統(tǒng)地表征GBM的自然發(fā)展過程，揭示疾病發(fā)展過程中免疫微環(huán)境重構(gòu)的潛在機(jī)制至關(guān)重要。
由于缺乏合適的模型和技術(shù)，目前尚不清楚腫瘤細(xì)胞在自然疾病發(fā)展過程中如何與腫瘤微環(huán)境相互作用。多灶性GBMs被認(rèn)為是研究GBM自然進(jìn)化的極好模型，因?yàn)樗鼈兛赡艽砹四[瘤發(fā)展的不同階段。越來越多的證據(jù)表明，大多數(shù)多灶性GBMs在早期由共同的腫瘤前體細(xì)胞克隆而來，并經(jīng)歷長(zhǎng)期的平行遺傳進(jìn)化。本文通過對(duì)多灶I(lǐng)DH野生型原發(fā)性GBMs應(yīng)用scRNA-seq來研究腫瘤進(jìn)展，從而對(duì)腫瘤自然進(jìn)化過程進(jìn)行的高分辨率描述。
基于單細(xì)胞mRNA表達(dá)譜推斷拷貝數(shù)變異結(jié)果顯示，四個(gè)病例中的兩個(gè)病變均來自同一祖先（圖2）。且NJ01和NJ02之間存在時(shí)間順序，其中一個(gè)病灶處存在拷貝數(shù)變化在其他病灶中未發(fā)現(xiàn)。這表明一個(gè)病灶可能是另一個(gè)病灶的種子。
RNA速度分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)腫瘤都有從第2個(gè)病灶向第1個(gè)病灶轉(zhuǎn)移的潛在趨勢(shì)(圖3C)。第2個(gè)病灶的腫瘤細(xì)胞可能是新的“bamboo shoots”，最終可能發(fā)展為第1個(gè)病灶的腫瘤細(xì)胞表型。第1個(gè)病灶可能比第2個(gè)病灶older。
根據(jù)非腫瘤細(xì)胞的組成成分，超過45%的非腫瘤細(xì)胞是髓樣細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)，這與之前的發(fā)現(xiàn)一致，髓樣細(xì)胞是GBM中主要的非腫瘤細(xì)胞群。在GBM中，腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞可能來源于外周骨髓衍生的巨噬細(xì)胞(BMDM)或駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)。在四個(gè)病例中識(shí)別了BMDM和MG細(xì)胞。第1個(gè)病灶的BMDMs與MG的比值高于第2個(gè)病灶(圖3F)。
在第一個(gè)結(jié)果中作者已經(jīng)確定了兩種病灶之間的時(shí)間順序，接著作者研究了何種轉(zhuǎn)錄特征可以表征這種進(jìn)化。差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)第1個(gè)病灶中表達(dá)的DEGs比例明顯高于第2個(gè)病灶(圖4A)，表明GBM的自然進(jìn)化可能伴隨著廣泛的基因激活。通過四個(gè)樣本中DEGs的重疊，保留了28個(gè)基因。這些基因被進(jìn)一步篩選在GBM中表達(dá)的基因，并進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用，得到一個(gè)由CD44、FOSL2和ANXA1等12個(gè)基因組成的模塊。將該模塊中的基因標(biāo)記為自然進(jìn)化特征(NES)，并假設(shè)更高的NES反映了更長(zhǎng)的進(jìn)化史。如圖4B所示，older病灶中表達(dá)NES基因的腫瘤細(xì)胞比例高于younger的病灶。ssGSEA構(gòu)建基于NES基因的評(píng)分算法。軌跡分析顯示，高NES可能是GBM的進(jìn)化終點(diǎn)(圖4C)。作者分別使用患者衍生外植體(PDEs)的數(shù)據(jù)集和小鼠模型，結(jié)果符合預(yù)期（圖4D,E）。
作者根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)特征分?jǐn)?shù)將細(xì)胞映射到一個(gè)六邊形圖中，NES顯示出從PN亞型到MES亞型的逐步增加和過渡方向(圖4G)。作者接著探討了NES與臨床結(jié)果之間的關(guān)系，分別使用TCGA和CGGA的GBM數(shù)據(jù)進(jìn)行了多因素cox分析，km曲線表明低NES(lNES)預(yù)后比高NES(hNES)組好(圖4H)。
之后作者研究了NES轉(zhuǎn)化過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在TCGA IDH野生型GBMs中發(fā)現(xiàn)了四個(gè)TF的調(diào)控活性評(píng)分與hNES顯著正相關(guān)以及一些在NES較低樣本中激活的TF(圖5A)。在這些轉(zhuǎn)錄因子中，E2F1和MYBL2都參與調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)。這些TF在大腦發(fā)育過程中也表現(xiàn)出明顯的表達(dá)模式(圖5B)，其中與hNES相關(guān)的TF更可能在發(fā)育后期表達(dá)。
那么促進(jìn)NES狀態(tài)轉(zhuǎn)變的潛在因素是什么？作者測(cè)試了NES與一系列微環(huán)境相關(guān)通路的相關(guān)性(圖5C)，其中缺氧反應(yīng)與NES顯著相關(guān)。通過比較不同氧水平(即5%和20%)培養(yǎng)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞的NES變化，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下腫瘤細(xì)胞的NES更高(圖5D)。低氧條件下敲除腫瘤細(xì)胞的低氧誘導(dǎo)因子(如HIF1A)，NES顯著降低，且siHIF1A處理的腫瘤細(xì)胞顯著降低了FOSL2 mRNA水平(圖5E，F(xiàn))，說明低氧在加速NES過渡中發(fā)揮了重要作用。基于ChIP-Atlas和ENCODE 的ChIP-seq分析顯示，在各種癌癥類型的FOSL2啟動(dòng)子上游區(qū)域(chr2:28618500-28618900)有一個(gè)HIF1A峰值(圖5G)。綜上所述，這些結(jié)果表明，缺氧可能通過HI1FA-FOSL2軸潛在地參與NES過渡。
將NES與TCGA IDH野生型GBMs中的BMDM和MG特征相關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)BMDM特征與NES呈正相關(guān)，而MG特征與NES無相關(guān)性(圖6A)。兩份GBM活檢(NJ03和NJ04)的CyTOF分析也顯示，hNES-like的GBM 有更高的BMDMs(圖6B)。
之后，作者分析了MRI定位活檢中GBM mRNA的表達(dá)譜。BMDM和NES在對(duì)比強(qiáng)化區(qū)域均表現(xiàn)出較高的富集分?jǐn)?shù)，在另一套數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)hNES樣本在PC區(qū)域顯著富集(圖6C,D)，提示BMDM和hNES腫瘤細(xì)胞容易在腫瘤組織的核心區(qū)域富集。綜上，這些發(fā)現(xiàn)提示BMDMs浸潤(rùn)可能與hNES腫瘤細(xì)胞有關(guān)。
作者將髓樣細(xì)胞重新聚類并識(shí)別了17個(gè)子簇。計(jì)算每個(gè)子聚類的M2-like和 BMDM-like signature分?jǐn)?shù)。發(fā)現(xiàn)mac_PLIN2、mac_IL32和mac_FCN1顯示了大量BMDM-like和M2-like特征的細(xì)胞。此外，基于TCGA IDH野生型GBMs的mRNA譜分析了這些BMDM相關(guān)子簇的分子標(biāo)記與NES之間的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)83%的signature與TCGA IDH野生型GBMs的NES評(píng)分呈正相關(guān)。
CellphoneDB發(fā)現(xiàn)“腫瘤細(xì)胞-髓細(xì)胞-T細(xì)胞”通訊軸是細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分(圖6F)。髓系細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)可能是腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間的中介細(xì)胞，這表明髓系細(xì)胞在促進(jìn)免疫微環(huán)境重構(gòu)和腫瘤進(jìn)展中具有重要作用。為了揭示BMDMs和hNES腫瘤細(xì)胞之間潛在的相互作用軸，CellphoneDB發(fā)現(xiàn)older病灶比younger病灶表現(xiàn)出更多的配體受體相互作用(圖6G)。在腫瘤簇中，ANXA1作為配體與BMDMs上的FPR1/3受體相互作用，主要在第1個(gè)病灶中(圖6G, H)。最后，通過探索TCGA IDH野生型GBMs的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ANXA1的表達(dá)與BMDM signature顯著相關(guān)(圖6I)，但與MG特征值無關(guān)，提示ANXA1可能與BMDMs浸潤(rùn)有關(guān)。
接下來，作者使用ChIP-Atlas尋找潛在的ANXA1調(diào)控因子。作為NES特征之一的轉(zhuǎn)錄因子FOSL2在三個(gè)神經(jīng)祖細(xì)胞上的ANXA1啟動(dòng)子上游區(qū)域出現(xiàn)了一個(gè)尖峰(圖7A)。TCGA IDH野生型GBMs中，ANXA1表達(dá)與FOSL2表達(dá)呈正相關(guān)(圖7B)。
為了確認(rèn)來自腫瘤細(xì)胞的ANXA1對(duì)單核細(xì)胞的影響，作者基于單核細(xì)胞和U251MG GBM細(xì)胞系進(jìn)行了Transwell遷移試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中，腫瘤細(xì)胞被敲除ANXA1 (siANXA1)或不敲除(siNC)。在對(duì)照組中，單核細(xì)胞更容易向腫瘤細(xì)胞遷移(圖7C)。72h后，與siANXA1組相比，對(duì)照組單核細(xì)胞表現(xiàn)出M2樣巨噬細(xì)胞的特征(圖7D)，也就是說ANXA1誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化至免疫抑制狀態(tài)。CD8+ T細(xì)胞與Transwell試驗(yàn)衍生的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的活性狀態(tài)對(duì)照組的IFN γ水平和T細(xì)胞增殖率顯著低于其他各組(siANXA1組)(圖7E)。在T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，僅用對(duì)照組Transwell實(shí)驗(yàn)即可觀察到類似的結(jié)果(圖7E)。這些發(fā)現(xiàn)在IVY GAP的mRNA表達(dá)中也得到了證實(shí)(圖7F)。
由于ANXA1可以深刻重塑腫瘤組織的免疫環(huán)境，那么，它是否可以幫助腫瘤細(xì)胞利用生存優(yōu)勢(shì)。通過比較顱內(nèi)注射有ANXA1敲低的GL261小鼠GBM細(xì)胞系的小鼠與對(duì)照組(圖7G, H)，對(duì)照組小鼠的腫瘤尺寸明顯大于另一組。shanx1組小鼠的中位生存時(shí)間明顯更長(zhǎng)(圖7K)。這說明ANXA1在抑制免疫活性和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用，可能是GBM治療的潛在靶點(diǎn)。
BMDM侵襲加速腫瘤NES轉(zhuǎn)移和遷移
通過分析GLASS的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBMs的mRNA圖譜，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性和匹配的原發(fā)性GBMs之間BMDM歸一化特征評(píng)分的差異與手術(shù)間隔時(shí)間的增加顯著相關(guān)(圖8A)。提示BMDM浸潤(rùn)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。對(duì)腫瘤細(xì)胞與M2樣巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24、48和72小時(shí)進(jìn)行RNA測(cè)序。共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的NES評(píng)分高于單一培養(yǎng)條件下的NES評(píng)分(圖8B)，表明BMDM細(xì)胞有助于加速NES轉(zhuǎn)化。此外，集富集分析發(fā)現(xiàn)，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)通路與NES顯著相關(guān)，且在共培養(yǎng)條件下高度上調(diào)，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步升高趨勢(shì)(圖8C)。有報(bào)道稱FOSL2是促進(jìn)EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子。FOSL2 mRNA在與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量較高(圖8D)。此外，EMT的富集也提示這些腫瘤細(xì)胞在共培養(yǎng)后可能具有侵襲能力。共培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)移的基因富集程度較高(圖8E)。此外，基于GSE126725數(shù)據(jù)的分析顯示，與對(duì)照組相比，具有高遷移能力的彌漫性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有更高的NES評(píng)分(圖8F)。
作者進(jìn)一步研究了BMDMs是否與GBMs相互作用并促進(jìn)腫瘤遷移。基于TCGA IDH野生型數(shù)據(jù)集的分析顯示，轉(zhuǎn)移樣信號(hào)與BMDM和單核細(xì)胞信號(hào)評(píng)分顯著相關(guān)(圖8G)。為了進(jìn)一步確定哪些細(xì)胞因子與NES轉(zhuǎn)移過程中的遷移能力相關(guān)，作者對(duì)TCGA IDH野生型GBMs中的細(xì)胞因子和NES進(jìn)行了相關(guān)分析。CCL2 和CCL20與NES評(píng)分高度相關(guān)(圖8H)。當(dāng)比較四對(duì)多灶性GBMs中表達(dá)這兩種基因的巨噬細(xì)胞的百分比時(shí)，發(fā)現(xiàn)CCL2易于在巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)(圖8I)。在另一套數(shù)據(jù)中腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞中CCL2 mRNA水平高于外周血周單核細(xì)胞(圖6K)，說明CCL2的上調(diào)只是浸潤(rùn)腫瘤的巨噬細(xì)胞的表型。在shCCL2或shNC(對(duì)照)條件下進(jìn)行了48小時(shí)的Transwell遷移試驗(yàn)(圖6L)，證實(shí)了CCL2可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。此外，通過分析TCGA IDH野生型GBM樣本，我們發(fā)現(xiàn)與其他患者相比，CCL2級(jí)別高的患者預(yù)后較差。
該研究整合了多灶性GBMs的單細(xì)胞RNA測(cè)序，確定FOSL2是older病灶中高表達(dá)的特征之一，表明它可能參與了腫瘤的進(jìn)化。此外，缺氧可能通過激活HIF1A-FOSL2軸潛在地促進(jìn)NES過渡。FOSL2調(diào)節(jié)ANXA1，隨后可能募集并誘導(dǎo)單核細(xì)胞極化為m2樣巨噬細(xì)胞(圖9)。這些極化的BMDMs顯示出免疫抑制表型，顯著減少CD8+ T細(xì)胞的增殖和IFNγ的產(chǎn)生，對(duì)GBM的免疫治療提出了挑戰(zhàn)。而ANXA1可能是GBM治療的潛在靶點(diǎn)。
作者的研究結(jié)果還表明，腫瘤細(xì)胞與極化巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)傾向于增加NES，這可能與多種轉(zhuǎn)錄因子(如FOSL2)和通路(如EMT)的激活有關(guān)。這種進(jìn)展還伴隨著遷移能力的增強(qiáng)，這與極化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2有關(guān)(圖9)。
