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SXR202211010C+干擾素刺激因子（STING）熱點(diǎn)再出高分文章

文獻(xiàn)解讀麻辣燙不要麻醬 ·2022年11月17日 14:49

干擾素刺激因子（STING）熱點(diǎn)再出高分文章

導(dǎo)讀

免疫抑制的腫瘤微環(huán)境是阻礙胰腺癌和其他實(shí)體癌治療的主要因素之一。干擾素基因刺激物(STING)蛋白激動劑可以觸發(fā)炎癥性先天免疫反應(yīng)，會改善腫瘤的免疫抑制性，但是其機(jī)制尚不清楚。在下文中，作者在各種胰腺癌模型中應(yīng)用STING激動劑。作者發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞中的STING信號的缺失可以更好的控制腫瘤。此外，使用IL-35阻滯劑或基因切除B細(xì)胞中的IL-35也可以減少腫瘤的生長。B細(xì)胞中的STING-IL-35軸會減少自然殺傷(NK)細(xì)胞的增殖，并減弱NK驅(qū)動的抗腫瘤反應(yīng)。

結(jié)果解讀

STING信號活化增強(qiáng)B細(xì)胞

為了研究體內(nèi)胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）對注射STING激動劑的應(yīng)答反應(yīng)，作者在小鼠體內(nèi)獲得PDAC KPC4662細(xì)胞系，并注射到WT小鼠體內(nèi)建立荷瘤模型，待腫瘤成型后，靜脈注射cGAMP，并在種植腫瘤的11，17，21天收集腫瘤進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)cGAMP并不影響腫瘤生長，也不影響腫瘤和脾臟中CD45⁺細(xì)胞的數(shù)量。然而在21天的時候，腫瘤中CD19⁺B細(xì)胞在CD45⁺細(xì)胞中占比上調(diào)，且B細(xì)胞的絕對數(shù)量增加。

為了研究STING在B細(xì)胞中的作用，作者比較了兩個原位PDAC腫瘤系(KPC2173和KPC4662)在對照組小鼠(Tmem173^fl/fl)和B細(xì)胞特異性缺失STING 1(也稱為Tmem173)基因的小鼠(Cd19^cre Tmem173^fl/fl)中的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于對照組Tmem173^fl/fl小鼠，Cd19^cre Tmem173^fl/fl小鼠腫瘤負(fù)荷均降低。同時，利用相同的模型，分別接種三陰乳腺癌細(xì)胞系E0771和Lewis肺癌細(xì)胞系LLC以及B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞系，也得到了類似的結(jié)果。

為了探討cGAMP（一種STING激動劑）對B細(xì)胞的影響，作者對WT和Tem173缺陷(Tmem173^?/?)小鼠的B細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序分析。作者發(fā)現(xiàn)cGAMP在WT中上調(diào)了IL10和Ebi3mRNA，但在Tem173^?/?B細(xì)胞中沒有上調(diào)。Ebi3是免疫抑制細(xì)胞因子IL-27和IL-35的一個亞單位，同時也是IL-12家族的成員。在B細(xì)胞中，IL-12家族成員的其他轉(zhuǎn)錄本則不受cGAMP的影響，而IL27、IL23a和IL12b的表達(dá)幾乎檢測不到。RT-PCR分析也證實(shí)了這些結(jié)果，結(jié)果表明，anti-IgM plus cGAMP能增加WT中EBI3、IL10、IFNA和IFNB1的表達(dá)，但對Tmem173^?/?B細(xì)胞中EBI3、IL10、IFNA和IFNB1的表達(dá)沒有影響，而p35mRNA水平保持不變（圖1）。

STING誘導(dǎo)B_reg細(xì)胞

為了確認(rèn)cGAMP誘導(dǎo)IL-10和IL-35，作者進(jìn)一步展開了體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)cGAMP可以增加WT中IL-35和IL-10的頻率，但對Tmem173^?/?B細(xì)胞沒有影響。這些CD19⁺IL-35⁺細(xì)胞是CD1d^hiCD5⁺CD21^hi B細(xì)胞，這是小鼠B_reg細(xì)胞的表型特征。與單獨(dú)anti-IgM相比，cGAMP加anti-IgM會進(jìn)一步增加IL-10的產(chǎn)生和CD19⁺CD1d^hiCD5⁺CD21^hi B_reg細(xì)胞的頻率。作者接下來測試了其他STING激動劑，如DMXAA，diABZI，ADU-S100和MSA-2，結(jié)果與cGAMP類似：能提高小鼠脾臟或腫瘤中IL-35⁺和IL10⁺Breg的頻率。但是對于cGAMP，DMXAA和diABZI并沒有減少腫瘤的生長。但增加了腫瘤和脾中CD19⁺IL-35⁺細(xì)胞的百分比，并增加了脾CD19⁺B細(xì)胞中EBI3和p35的水平。cGAMP還可提高瘤內(nèi)B細(xì)胞中IL-35⁺CD19⁺和IL-10⁺CD19⁺細(xì)胞的比例（圖2）。

圖2 STING激活有助于IL-35⁺和IL-10⁺B_reg細(xì)胞的擴(kuò)增

STING-IRF3信號通路介導(dǎo)B_reg分泌細(xì)胞因子

為了進(jìn)一步研究 STING介導(dǎo)的B_reg信號通路，作者敲除了B細(xì)胞的Tmem173或IRF3后，激動劑信號刺激并不影響IL-35⁺和IL-10⁺B細(xì)胞頻率變化；CHIP實(shí)驗(yàn)顯示，激動劑刺激條件下，IRF3結(jié)合EBI3，p35和IL-10的啟動子的強(qiáng)度增加，說明CD19⁺B細(xì)胞中IL-35和IL-10表達(dá)上調(diào)是通過STING- IRF3信號通路。同時體內(nèi)試驗(yàn)顯示，注射cGAMP后，WT小鼠腫瘤和脾臟中IL-35和IL-10的水平顯著升高，腫瘤負(fù)荷更強(qiáng)，但是Cd19^creTmem173^fl/fl小鼠中，IL-35和IL-10不受cGAMP調(diào)控，注射前后均維持不變。

接下來，作者研究了PDAC中IL-35和IL-10的來源。隨著腫瘤的生長，這兩種細(xì)胞因子在腫瘤中都增加了，cGAMP可以增加這些細(xì)胞因子在腫瘤中的表達(dá)。在B細(xì)胞缺陷的小鼠中，腫瘤內(nèi)的IL-35和IL-10幾乎消失，表明這些細(xì)胞因子來自B細(xì)胞。在cGAMP治療的CD19^creTem173^fl/fl PDAC荷瘤小鼠中，IL-35和IL-10保持在基線水平，表明B細(xì)胞中的STING通路是增加IL-35和IL-10所必需的。為了分析這些免疫抑制細(xì)胞因子對腫瘤的影響，作者發(fā)現(xiàn)KPC4662腫瘤中IL-35和IL-10的增加與腫瘤重量呈正相關(guān)，與腫瘤浸潤性CD8⁺、CD4⁺和NK1.1⁺效應(yīng)細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖2)。

IL35⁺B細(xì)胞損傷NK細(xì)胞功能

接下來，作者研究了cGAMP對EBI3、p35或IL10 B細(xì)胞特異性缺陷小鼠的治療效果，分別命名為B(EBI3^?/?)(CD19^creEbi3^fl/fl)、B(p35^?/?)和B(IL10^?/?)。將這些菌株原位注射KPC細(xì)胞，并用PBS或cGAMP處理，作者發(fā)現(xiàn)cGAMP能有效抑制B（BEbi3^?/?）和B（p35^-/-）小鼠腫瘤生長；相反，cGAMP促進(jìn)了B（Ebi3^+/-），B（WT），B（Il10^-/-）小鼠腫瘤中IL-35⁺B細(xì)胞的浸潤。同時，敲除B細(xì)胞中的Ebi3或p35后，略微增加了腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞的水平； cGAMP處理后，NK GzmB⁺細(xì)胞頻率顯著提高。而其他類型的免疫細(xì)胞，如IL-35⁺或IL-10⁺ CD4⁺T細(xì)胞，均不受cGAMP 影響，說明B_reg特異性來源的IL-35會導(dǎo)致NK細(xì)胞頻率降低（圖3）。

圖3 B細(xì)胞中IL-35的消融與STING激動劑協(xié)同調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性

接下來，作者評估了cGAMP聯(lián)合IL-35或IL-10中和抗體是否可以控制PDAC、LLC或B16-OVA黑色素瘤的生長。小鼠模型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，相比單體治療，聯(lián)合治療能有效提高NK1.1⁺或NK1.1⁺GzmB⁺細(xì)胞以及CD8⁺TNF⁺T細(xì)胞的腫瘤浸潤，并有效降低腫瘤負(fù)荷，提高生存率。但在消除小鼠的NK1.1⁺細(xì)胞或CD8⁺T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療的有效性只在缺失NK1.1⁺細(xì)胞的小鼠中出現(xiàn)，說明聯(lián)合治療的抗腫瘤效應(yīng)是由NK細(xì)胞介導(dǎo)的。同時體外實(shí)驗(yàn)顯示，IL-35通過降低NK細(xì)胞的TRAIL的表達(dá)繼而削弱其細(xì)胞殺傷功能。由于cGAMP和anti-IL-35的結(jié)合增加了原位PDAC中NK1.1⁺和CD8⁺亞群的數(shù)量，作者通過耗盡NK或CD8⁺T細(xì)胞來測試這些細(xì)胞類型在腫瘤抑制中的相關(guān)性。當(dāng)NK1.1⁺細(xì)胞耗盡時，cGAMP加anti-IL-35治療后的腫瘤減少的現(xiàn)象就消失了。這說明雙重治療的抗腫瘤作用是由NK細(xì)胞介導(dǎo)的。為了進(jìn)一步探討IL-35和NK細(xì)胞之間的這種聯(lián)系，作者在體外將NK細(xì)胞系NK-92MI與IL-35共同孵育，發(fā)現(xiàn)IL-35處理降低了NK細(xì)胞對K562的殺傷活性(K562是一種典型的NK靶細(xì)胞)。為了探索降低NK細(xì)胞毒性的可能機(jī)制，作者檢測了NK殺傷的關(guān)鍵介質(zhì)TRAIL的表達(dá)，結(jié)果表明IL-35降低了NK細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)水平。最后，anti-TRAIL中和抗體在雙重治療后削弱了腫瘤減少的現(xiàn)象（圖4）。

圖4抗IL-35與STING激動劑協(xié)同增強(qiáng)NK細(xì)胞效應(yīng)

進(jìn)一步解析cGAMP和anti-IL-35聯(lián)合治療是如何影響腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞功能。作者分離了藥物單藥/聯(lián)合治療的小鼠腫瘤模型中的NK細(xì)胞，通過單細(xì)胞測序和GSEA分析發(fā)現(xiàn)多條通路受到藥物治療的影響而增強(qiáng)，其中包括細(xì)胞增殖，細(xì)胞發(fā)育，細(xì)胞殺傷功能。聯(lián)合治療提高了NK細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)NK1.1⁺Ki 67⁺細(xì)胞的比例和頻率顯著提高。為了區(qū)分聯(lián)合治療和單一治療的效果，作者注意到聯(lián)合治療與對照組相比上調(diào)了358和下調(diào)了610的DEGs，cGAMP或anti-IL-35組與對照組相比沒有變化。單藥處理沒有明顯改變，但聯(lián)合處理增加的基因包括Tubb1，促進(jìn)細(xì)胞增殖。作者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療會導(dǎo)致NK細(xì)胞增殖，具體的表現(xiàn)為腫瘤中NK1.1⁺Ki67⁺細(xì)胞總數(shù)和百分比的增加。為了研究人類胰腺腫瘤中STING和免疫抑制細(xì)胞因子之間的聯(lián)系，作者研究了TCGA的胰腺癌數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)顯示，人類EBI3，IL12A，IL0的表達(dá)和Tmem173的轉(zhuǎn)錄是呈正相關(guān)。cGAMP處理能上調(diào)健康人或胰腺癌患者B細(xì)胞中EBI3，IL2A的表達(dá)。通過分析B細(xì)胞亞型，發(fā)現(xiàn)cGAMP處理后，選擇性的上調(diào)未成熟B細(xì)胞以及Br1細(xì)胞中EBI3和IL12 A的表達(dá)水平。最后，數(shù)據(jù)調(diào)取分析顯示，胰腺癌中，B_reg細(xì)胞表型和NK細(xì)胞活化表型呈負(fù)相關(guān)。

圖5 STING激動劑治療可以通過IL-35抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)

全文總結(jié)

綜上，整篇研究揭示了腫瘤抵抗STING激動劑單藥治療的可能機(jī)制。STING激動劑作用于腫瘤中的Breg細(xì)胞，激活STING- IRF3信號通路，上調(diào)IL-35的表達(dá)和分泌，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的增殖，削弱NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤殺傷功能。但聯(lián)合STING激動劑和anti-IL-35抗體治療，在小鼠模型中能顯著限制抑制腫瘤生長，提高生存期，為臨床克服腫瘤免疫抑制提供了新的治療思路。

參考文獻(xiàn)：

1 S. Li, B. Mirlekar, B.M. Johnson, W.J. Brickey, J.A. Wrobel, N. Yang, D. Song, S. Entwistle, X. Tan, M. Deng, Y. Cui, W. Li, B.G. Vincent, M. Gale, Jr., Y. Pylayeva-Gupta, J.P. Ting, STING-induced regulatory B cells compromise NK function in cancer immunity, Nature, 610 (2022) 373-380.