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跟著nature學習如何探究腫瘤免疫逃逸形成機制
哈嘍大家好，免疫逃逸一直是腫瘤研究領域的熱門話題，也是抗癌的難題。今天給大家介紹一篇2022年12月14日發(fā)表在nature上的文章，從多個角度深入探究卵巢癌的免疫逃逸機制。
題目為“Ovarian cancer mutational processes drive site-specific immune evasion”
摘要
背景及方法：高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）是一種典型的基因組不穩(wěn)定的癌癥，具有不同的突變過程、腫瘤異質(zhì)性和腹腔內(nèi)擴散等特點。免疫療法對HGSOC的療效有限，這突出了一個尚未得到滿足的需求，即評估突變過程和腫瘤病灶的解剖部位是如何決定腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)的。在這里，作者對42例未接受治療的HGSOC患者的160個腫瘤位點進行了全基因組測序、單細胞RNA測序、數(shù)字組織病理學和多路免疫熒光的綜合分析。
主要結(jié)果：同源重組缺陷型HRD Dup（BRCA1突變樣）和HRD Del（BRCA2突變樣）腫瘤含有炎癥信號和持續(xù)的免疫編輯，反映出HLA多樣性的喪失和高分化功能失調(diào)CD8+T細胞的腫瘤浸潤。相比之下，攜帶折疊后反轉(zhuǎn)的腫瘤表現(xiàn)出較高的免疫抑制TGFβ信號和免疫排斥，主要是幼稚/干細胞樣和記憶T細胞。表型狀態(tài)關聯(lián)是特定于解剖部位的，突出了附件腫瘤和遠端腹膜粘膜灶之間的組成、拓撲和功能差異。
該研究結(jié)果表明，解剖部位和突變過程是HGSOC進化表型差異和免疫抗性機制的決定因素。該研究提供了一個多組學細胞表型數(shù)據(jù)基礎，從中開發(fā)和解釋未來的個性化免疫治療方法和早期檢測研究。
接下來，我們詳細看一下作者的整體研究吧。
背景前言
高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）的主要定義特征是拷貝數(shù)改變和基因組重排形式的深刻結(jié)構變異，這是在幾乎普遍存在的TP53突變的遺傳背景下產(chǎn)生的。在大約一半的HGSOC病例中，同源重組（HR）修復途徑基因如BRCA1和BRCA2的體細胞和種系改變導致HR缺陷（HRD）。
除了基因改變，患者通過內(nèi)源性突變過程進行分層，從全基因組測序（WGS）的結(jié)構突變模式推斷，包括HRD亞型（BRCA1相關串聯(lián)重復，HRD-Dup；BRCA2相關間質(zhì)缺失，HRD-Del），CCNE1擴增相關折疊倒置（FBI）的腫瘤和攜帶cdk12相關串聯(lián)重復器（TD）的腫瘤。
HGSOC提出了一個獨特的臨床挑戰(zhàn)，導致廣泛的腹腔內(nèi)疾病的診斷。長潛伏期允許克隆多樣化和腫瘤免疫相互作用在腹膜腔的異質(zhì)性微環(huán)境中展開。這提出了一個關鍵問題，即潛在的突變過程和局部組織位點如何影響克隆選擇、腫瘤微環(huán)境（TMEs）和免疫識別。
因此作者進行了一項前瞻性研究，從WGS中捕獲突變過程，從單細胞RNA測序（scRNA-seq）和在多位點的HGSOC病例中，基于原位多路細胞成像的空間拓撲結(jié)構。我們的研究發(fā)現(xiàn)確定了不同的免疫刺激和免疫抑制機制，它們與疾病位點和突變過程共同分離，從而定義了HGSOC中免疫識別和逃逸的新決定因素。
結(jié)果
工作流程及患者信息
在24個月的時間內(nèi)，從新診斷的、未接受治療的患者中收集了多個部位的組織活檢，這些患者正在接受腹腔鏡手術或初級去瘤手術。采集的解剖部位包括附件（即潛在原發(fā)病變）、網(wǎng)膜、網(wǎng)膜、腹膜、腸、腹水和其他腹腔內(nèi)部位（圖1a）。所有患者的臨床特征見圖1b。
患者樣本分析使用CD45+和CD45?流分類分數(shù)，蘇木精和伊紅（H&E）染色和多路免疫熒光（mpIF）固定組織切片，臨床腫瘤正常MSK影響和全基因組腫瘤基因測序腫瘤正常測序（圖1）。
擴展數(shù)據(jù)圖1
位點特異性TME
根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)構建細胞類型圖，量化了9種廣泛的細胞譜系：上皮細胞、淋巴細胞（T和自然殺傷細胞（NK）細胞、B細胞、漿細胞）、骨髓細胞（單核/巨噬細胞、樹突狀細胞（DC）、肥大細胞）和基質(zhì)細胞（成纖維細胞、內(nèi)皮細胞）（圖2b、d）。
卵巢癌細胞表現(xiàn)出較高的患者特異性（圖2c），這歸因于腫瘤細胞特異性體細胞拷貝數(shù)的改變驅(qū)動基因劑量效應?；颊唧w內(nèi)免疫細胞的組成不同（圖2e、f）。CD45?組分（從富成纖維細胞到富癌細胞樣本）在解剖部位之間大部分保守（圖2g），而CD45+組分（從富髓系細胞到富淋巴細胞樣本）有很大的差異（圖2f、g）。不出所料，腹水樣本富集T細胞和樹突狀細胞，而附件樣本富集的T細胞、B細胞和樹突狀細胞相對減少。在實體腫瘤部位中，在腫瘤和基質(zhì)區(qū)域的scRNA-seq、整個載玻片H&E和mpIF（圖2g-i）中的非附件部位中發(fā)現(xiàn)了較高的淋巴細胞和CD8+T細胞分數(shù)。
圖2
位點間成分變化引出更深入的分析，以評估免疫細胞表型狀態(tài)。作者確定了10個主要的T和NK細胞集群與41個小子集群（圖3a），廣泛定義CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、先天的和γδT細胞、NK細胞和循環(huán)細胞。T和NK細胞簇遵循均勻流形近似和投影（UMAP）空間的梯度（圖3b），突出了位點特異性的表型差異，這些差異通過擬合聚類組成的廣義線性模型（GLM）來量化（圖3c）。
特別是，在附件樣本中，幼稚/干細胞樣和中央記憶CD4+ T細胞被耗盡，而在腹水中富集。相反，功能失調(diào)的CD4+和CD8+ T細胞在腹水中耗盡，但在附件和其他腫瘤部位富集，這與實體腫瘤中慢性抗原暴露驅(qū)動的功能障礙一致。調(diào)節(jié)性T細胞和調(diào)節(jié)性NK細胞的簇也在附件樣本中富集（圖3c），這可能表明這些位點的免疫調(diào)節(jié)反饋增加。
患者實體腫瘤部位的比較顯示，非附件部位的幼稚/干樣和中央記憶T細胞富集，附件部位的功能失調(diào)的T細胞富集。附件樣本中T細胞表型的位點內(nèi)變異較高，表明患者體內(nèi)和患者之間實體瘤和腹水的成分差異很大（圖3d）。
分化軌跡沿著終末功能失調(diào)和干擾素刺激基因T細胞狀態(tài)的兩個軸投射CD8+T細胞（圖3e），定義為幼稚T細胞標記物的丟失和附件和網(wǎng)膜的獲取，功能失調(diào)和細胞毒性性狀（圖3f）。值得注意的是，不同部位的表達軌跡也不同，腹水表現(xiàn)出較高的細胞毒性模塊分數(shù)，而附件和網(wǎng)膜中的T細胞功能失調(diào)分數(shù)較高。
髓系和DC隔室中的表型狀態(tài)組成也隨著部位的變化而變化。因此，淋巴細胞和髓細胞的表型免疫狀態(tài)分化與腫瘤部位密切相關，這是TME患者內(nèi)部和患者之間變異的基礎，并提供了腹水免疫表型成分不代表實體瘤的明確證據(jù)。
圖3
腫瘤細胞表型多樣性
接下來，作者定義了癌細胞的突變過程如何影響癌細胞的內(nèi)在信號傳導和免疫表型。從CD45?細胞中鑒定出了10個上皮簇（圖4a），包括具有升高的Janus激酶（JAK）-信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活物（STAT）、核因子（NF）-κB和腫瘤壞死因子（TNF）信號（Cancer.cell.3）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）信號（Cancer.cell.4）和缺氧（Cancer.cell.6）的細胞（圖4b）。突變特征特異性聚類富集包括HRD-Dup中的Cancer.cell.3和FBI中的Cancer.cell.6（圖4c，d）。與FBI病例相比，在HRD-Dup病例的附件病變中，Cancer.cell.3中的所有三種免疫信號通路均顯著增加（圖4e）。相比之下，TGFβ信號在FBI病例的非附件部位更為顯著。
值得注意的是，癌細胞簇因主要組織相容性復合體（MHC）編碼基因的表達而不同（圖4f）。MHC I類基因和MHC II類基因在Cancer.cell.3中高度表達（圖4f）。雖然在樣本水平上，Shannon熵在突變特征中顯示出相似水平的細胞內(nèi)在多樣化，但FBI腫瘤在附件樣本對中表現(xiàn)出更高的Bray-Curtis差異（圖4g），潛在地表明這些癌細胞在遷移到遠端位點時具有更大的表型多樣性能力。
圖4
此外，觀察到原始T細胞和功能失調(diào)T細胞的明顯組成差異是突變特征（圖5a），F(xiàn)BI腫瘤中原始/干樣和中央記憶T細胞簇和HRD腫瘤中功能失調(diào)的T細胞富集（圖5b），這同樣反映在HRD Dup腫瘤中較高的JAK-STAT信號（圖5c）和T細胞表型的分化軌跡（圖5d）。T細胞固有和癌細胞固有JAK-STAT信號在突變亞型的匹配樣本中相關（圖5e）。在HRD Dup腫瘤中發(fā)現(xiàn)了更高的表型T細胞狀態(tài)多樣性，伴隨著患者內(nèi)顯著一致的Bray-Curtis指數(shù)，這表明多樣化過程在患者之間反復發(fā)生（圖5f）。
使用mpIF，測試了HRD腫瘤中增強的免疫信號是否可以歸因于腫瘤中的癌細胞和免疫細胞之間的相互作用以及TME中的間質(zhì)隔間（圖5g）。與附件樣本相比，活化CD8+PD-1+TOX? T細胞在非附件樣本中更為普遍，HRD亞型中的差異比FBI病例中的差異更為明顯（圖5g），這意味著T細胞-抗原相互作用減少（圖5g）。
圖5
突變過程驅(qū)動免疫編輯
接下來研究了HRD亞型中免疫信號的增加是否導致介導免疫逃逸的機制。作者使用SIGNALS算法描述了通過單細胞水平上攜帶HLA I類和II類基因的染色體臂6p雜合性缺失（LOH）推斷的HLA呈遞機制的缺失。預測僅限于癌細胞（圖6a），每個細胞B等位基因部分（BAF）被分類為平衡的，不平衡或LOH和來自位點匹配的WGS和MSK-IMPACT數(shù)據(jù)集的正交基因組驗證。作者觀察到明顯的患者間異質(zhì)性（圖6b，c）。值得注意的是，47個樣本中的5個樣本的附件損傷中存在克隆性6p LOH（圖6e），與主要位點的“早期”免疫進化選擇一致。
HRD Dup亞型患者022和FBI亞型患者065進一步顯示了6p LOH的患者特異性進化時間（圖6f）。還觀察到HRD Dup中6p LOH的功能后果，包括JAK–STAT信號的上調(diào)，這在腸樣本中最為明顯，以及功能失調(diào)的CD4+和CD8+T細胞的增加（圖6g）。總之，HLA等位基因的LOH與JAK-STAT信號傳導增強和T細胞功能障礙的關聯(lián)表明，HRD Dup腫瘤中6p丟失的“早期”免疫介導的進化選擇，與FBI腫瘤中6pLOH的進化“晚期”克隆擴增相反。
圖6
微環(huán)境的空間拓撲
上述單細胞分析將免疫表型變異與突變特征和腫瘤部位聯(lián)系起來。作者試圖通過對主要免疫細胞類型（T細胞和巨噬細胞）及其功能標志物（PD-1、TOX、PD-L1）的原位mpIF分析，通過腫瘤-免疫細胞相互作用和空間拓撲來驗證這些發(fā)現(xiàn)。
突變特征也影響細胞相互作用，正如從scRNA-seq數(shù)據(jù)得出的髓系簇中PD-L1（CD274）和HRD亞型中T和NK細胞簇中PD-1（PDCD1）的更高受體-配體共表達所預測的。細胞鄰域的空間組織也因突變亞型而異，這反映在T細胞和panCK+PD-L1+癌細胞之間的最近鄰距離上（圖7a）。當結(jié)合位點和特征時，在HRD Dup附件和腸樣本中觀察到最短的中值距離，特別是在激活/功能失調(diào)和功能失調(diào)的T細胞室中（圖7b），支持PD-L1作為HRD腫瘤中激活T細胞的負反饋機制。總體而言，mpIF分析進一步強調(diào)了位點和突變特征依賴性TME，與基于scRNA-seq的觀察結(jié)果一致。
圖7
小結(jié)
整體來說，該研究結(jié)果綜合了解剖位點和突變過程，作為HGSOC TMEs及其表型狀態(tài)的決定因素。雖然附件部位免疫細胞的相對缺乏是由卵巢和輸卵管的免疫特權驅(qū)動的，但這些部位功能失調(diào)的T細胞占優(yōu)勢反映了癌癥發(fā)展早期的免疫反應性及轉(zhuǎn)移部位的免疫逃逸。此外，特定的轉(zhuǎn)移部位可能存在組織特異性的免疫監(jiān)測限制。TME內(nèi)和TME間的高度異質(zhì)性強調(diào)了免疫抵抗機制在特定患者中并不是普遍的，需要解釋單個腫瘤中免疫反應的進化。
總之，該研究提供了廣泛的多模態(tài)資源，繪制了HGSOC TMEs的細胞成分，并將它們與突變過程和空間環(huán)境聯(lián)系起來。結(jié)果表明即使是個性化的治療方法也可能對患者體內(nèi)廣泛的異質(zhì)性疾病無效，這突出了在擴散到腹膜腔之前迫切需要早期發(fā)現(xiàn)。
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