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單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合分析

生信干貨橘子 ·2023年1月28日 09:47

近些年，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)和空間組學(xué)技術(shù)的興起為科研人員的精準(zhǔn)研究提供了堅實的基礎(chǔ)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的結(jié)合分析已然成為癌癥治療研究的新熱點。接下來，小編將給大家介紹一下單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的經(jīng)典文章。

一．腎癌瘤內(nèi)和相關(guān)區(qū)域的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

Mapping single-cell transcriptomes in the intra-tumoral and associated territories of kidney cancer于2022年11月23日發(fā)表在Cancer Cell上。英國韋爾科姆基金會桑格研究所Thomas J. Mitchell等研究人員合作繪制出腎癌瘤內(nèi)和相關(guān)區(qū)域的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。作者研究了12名腎臟腫瘤患者的約27萬個細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，然后用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)進行驗證。作者發(fā)現(xiàn)，CD8⁺T細(xì)胞克隆型的組織類型位置在很大程度上定義了它們的耗竭狀態(tài)，而腫瘤內(nèi)的空間異質(zhì)性并不能很好地解釋體細(xì)胞異質(zhì)性?；趕cRNA-seq數(shù)據(jù)的新突變識別使作者能夠廣泛地推斷基質(zhì)細(xì)胞的克隆性和譜系并追蹤髓系細(xì)胞的分化。此外，作者發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞具有六個元程序以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化程序在腫瘤-正常界面高度富集，并與IL1B⁺巨噬細(xì)胞共同定位，這為腎癌的治療提供一個潛在的治療靶點。

以下是結(jié)果簡述：

1.多區(qū)域的腎癌基因組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

樣本測序信息：1）從12名腎癌患者的外周血、正常腎臟、腫瘤核心的四個不同的區(qū)域和腫瘤正常界面中采集組織。此外，還采集了腎周脂肪、正常腎上腺、腎上腺轉(zhuǎn)移和腫瘤血栓的組織（圖1A），scRNA-seq和scTCR-seq測序數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。2）8名患者的11個腫瘤正常界面和5個腫瘤核心組織切片進行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)。3）100例樣本進行了全外顯子組測序（WES）分析。

基于scRNA-seq，根據(jù)典型標(biāo)記基因的表達，可將其大致分為12種主要細(xì)胞類型（圖1B、1C）。接下來，作者并觀察到不同的組織中具有不同細(xì)胞類型分布（圖1D）。隨后，進一步對主要細(xì)胞類型進行了亞群分析，從而確定不同組織中105個細(xì)胞亞群的差異性分布（圖1E）。整合四個最近發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)集并且完善了細(xì)胞類型注釋，顯著改善了其TME的表征（圖2）。

對于NK細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)主要包括NCAM1和FCGR3A表達亞群和一種表達KRT81和KRT86亞群，其可能主要在腫瘤組織中富集（圖1E）。對于內(nèi)皮細(xì)胞，作者鑒定了IGFBP3⁺EC和膠原相關(guān)EC亞群，發(fā)現(xiàn)它們在腫瘤組織中顯示出顯著的富集（圖1E）。膠原相關(guān)EC在界面中更富集，可能通過細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生在TME相互作用中發(fā)揮作用。作者還發(fā)現(xiàn)界面中可能富集了表達膠原的成纖維細(xì)胞亞群（圖1E）。這表明，不同的ECM產(chǎn)生基質(zhì)細(xì)胞傾向于在界面中富集和共定位，可能發(fā)揮多種功能，包括細(xì)胞外環(huán)境重塑和細(xì)胞間相互作用。

圖2：已發(fā)表單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的細(xì)胞類型注釋

2. CD8⁺T細(xì)胞克隆型的擴增及組織定位對其耗竭狀態(tài)的影響

根據(jù)典型標(biāo)記基因的表達，作者確定了代表不同T細(xì)胞功能狀態(tài)的CD8⁺T細(xì)胞亞群（圖3A）。作者鑒定了高度表達組織駐留標(biāo)記物（ITGAE和CD69）并特異性表達CXCL13的駐留記憶T（TRM）細(xì)胞（圖3A）。先前研究報道CXCL13⁺CD103（ITGAE）⁺ CD8⁺T細(xì)胞在介導(dǎo)人類癌癥中的B細(xì)胞募集和三級淋巴結(jié)構(gòu)形成中發(fā)揮重要作用。他們還發(fā)現(xiàn)高表達FGFBP2和CX3CR1的亞群在外周血中顯著富集（圖3A和1E），因此，該細(xì)胞群可能代表激活的效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD8⁺TEMRA）。還確定了兩個高表達LAG3、TIGIT、PDCD1、HAVCR2和CTLA4基因的耗竭型CD8T細(xì)胞群，其中有一個群具有最高的LAG3表達，并特異性表達IL10（圖3A）。在之前已報到的四個RCC單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中未發(fā)現(xiàn)表達IL10的CD8+T細(xì)胞（圖2）。除此之外，作者還鑒定了兩個gdT細(xì)胞簇，gdT_Vd1（表達TRDV1）和gdT_Vd2（表達TRDV 2），這在之前的四項RCC研究中也沒有報道（圖2和3A）。

接下來，作者對CD8⁺T細(xì)胞進行了偽時間分析（圖3B）。隨著偽時間，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性相關(guān)基因（KLRG1、GNLY和GZMH）逐漸下調(diào)，而耗竭相關(guān)基因（CTLA4、HAVCR2和LAG3）逐漸上調(diào)（圖3C）。然而，前體耗竭相關(guān)基因（CXCR4、GZMK和GZMA）先上調(diào)，然后沿著偽時間逐漸下降（圖3C）。此外，將前十個擴增的TCR克隆型映射到軌跡上，觀察到單個TCR譜系通常被限制在相似的表型狀態(tài)，而不是分布在整個軌跡上（圖3D）。在多個患者中觀察到高度擴增的TCR克隆，每個克隆有100多個細(xì)胞，其中顯著高達30%的CD8⁺T細(xì)胞可來自單個克隆型（圖3E）。在耗竭的克隆型中，許多最擴增的CD8⁺TCR克隆具有相當(dāng)比例的細(xì)胞周期循環(huán)細(xì)胞（圖3E）。這一發(fā)現(xiàn)與之前在黑色素瘤中的發(fā)現(xiàn)類似，腎癌中高度耗竭的T細(xì)胞的增殖尚未完全停止。作者還發(fā)現(xiàn)，無論克隆大小，平均耗竭程度和外周血中檢測到的CD8⁺TCR克隆型都是強反相關(guān)的，并且在外周血中很少檢測到耗竭的克隆型（圖3F）。就耗竭程度而言，CD8⁺T細(xì)胞的表型狀態(tài)顯示出對克隆擴增和組織位置的強相關(guān)性（圖3G）。

3. 空間定位主要影響CD8⁺克隆型異質(zhì)性

作者利用WES數(shù)據(jù)中的體細(xì)胞突變構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，以闡明腫瘤的克隆進化和ITH，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)檢測到的驅(qū)動突變和關(guān)鍵CNV由單個腫瘤內(nèi)的所有腫瘤克隆共享（圖4A）。除此之外，作者通過比較了個體腫瘤中CD8⁺T細(xì)胞的體細(xì)胞突變、空間定位和TCR克隆型之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的克隆型在單個區(qū)域中頻繁富集（圖4B）。在腫瘤細(xì)胞上產(chǎn)生新抗原的體細(xì)胞突變被認(rèn)為是抗原呈遞后T細(xì)胞克隆擴增的驅(qū)動因素。這一發(fā)現(xiàn)表明，TCR克隆擴增的異質(zhì)性更多地與組織中T細(xì)胞的不同空間定位有關(guān)，而不是與體細(xì)胞突變的ITH有關(guān)。隨后作者通過驗證發(fā)現(xiàn)CD8⁺T細(xì)胞中的TCR異質(zhì)性與空間定位比與體細(xì)胞異質(zhì)性更密切相關(guān)（圖4C）。

作者還使用GLYPH2算法對預(yù)測識別相同表位的TCR進行聚類，共檢測到了擴展克隆型之間共享的六種模式（圖4D）。其中一種模式（SQDR%TDT）在兩種克隆型的不同腫瘤區(qū)域富集。其中兩種模式（SLGAG%TE和SVGQ%YE）代表著在成熟的不同階段出現(xiàn)的克隆型，每種模式都有一種克隆型存在于外周血和正常組織中，另一種模式在高耗竭水平的腫瘤中富集（圖4D）。

4. 髓系細(xì)胞的區(qū)域特征和進化

作者對髓細(xì)胞亞群分析，發(fā)現(xiàn)簇1、2、3和4 高表達CD14但缺乏FCGR3A表達為經(jīng)典單核細(xì)胞主要存在于外周血中。簇5代表循環(huán)非經(jīng)典單核細(xì)胞，F(xiàn)CGR3A高表達，但CD14缺乏表達。還鑒定了三種樹突狀細(xì)胞（DC）簇： pDC、cDC1和cDC2，其特征分別是JCHAIN、CLEC9A和CD1C的特異性表達（圖5A），以及肥大細(xì)胞特異性高表達TPSAB1，可能在腫瘤核心中富集（圖5B）。

作者還發(fā)現(xiàn)與其他正常組織相比，六個巨噬細(xì)胞簇（簇11–16）優(yōu)先富集于腫瘤核心/界面，因此被定義為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。其余三個簇（簇6、簇7和簇8）在正常組織/界面中顯示富集，并被視為組織駐留巨噬細(xì)胞（TR Mac）（圖5B）。在六個TAMs簇中，MHC-II TAM（簇14）高度表達HLA-DRB5、APOE和APOC1，并且在腫瘤核心中比在腫瘤正常界面中更富集。相比之下，其他五個TAM簇在腫瘤核心和界面顯示出相似程度的富集（圖5B）。FN1⁺TAM高表達FN1和MARCO（圖5C），其先前被報道為腎癌中的特異性巨噬細(xì)胞亞群。還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1⁺TAM可能是RCC中的促瘤因子，該細(xì)胞群上調(diào)MDSC和M2極化相關(guān)基因（圖5D）。并且發(fā)現(xiàn)還高表達APOC4-APC2和TREM2基因的SPP1⁺TAM簇（圖5C）。在三個TR Mac群中，TR Mac.2在界面處富集（圖5B），并且高度表達IL1B和AREG（圖5C）;TR Mac.3顯示SEPP1和MRC1的高表達，并且在正常腎上腺中富集（圖5B和5C），但是TR Mac.3具有極高的M2和吞噬細(xì)胞特征表達，并表現(xiàn)出與FN1⁺TAM簇相似的通路激活（圖5D、5E）。使用RNA速度分析，作者發(fā)現(xiàn)組織中從循環(huán)單核細(xì)胞到巨噬細(xì)胞有兩種明顯的定向流動：（1）從經(jīng)典mono.3至TR Mac.2和（2）從非經(jīng)典mono至TR-Mac.1，TR Mac.1和TR Mac.2然后可能在組織中產(chǎn)生其他類型的巨噬細(xì)胞（圖5F）。隨后，作者利用體細(xì)胞突變分析（圖5G），發(fā)現(xiàn)循環(huán)單核細(xì)胞與組織中的巨噬細(xì)胞分離，與其他經(jīng)典單核細(xì)胞相比，非經(jīng)典單核與組織中巨噬細(xì)胞的關(guān)系更密切。

5.腫瘤細(xì)胞元程序以及區(qū)域富集和預(yù)后

作者使用NMF解析了由每個腫瘤中的共表達程序，從10個ccRCC腫瘤中解析了45個瘤內(nèi)表達程序，得到了多個腫瘤共享的六個元程序（MP）（圖6A，6B）。MP1高表達FOS和JUN，代表了腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)特征。MP2高表達了近端小管（PT）細(xì)胞特異性表達的基因（NAT8和ACSM2B）。MP3上調(diào)了TGFBI和MT2A等基因（圖6B），這些基因與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)（圖2）。MP4高表達NEAT1和HCG18，反映了一些應(yīng)激或細(xì)胞死亡（CD）相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)。MP5高表達MHC II相關(guān)基因如CD74和HLA-DRA。MP6高表達TOP2A和MKI67，與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。

接下來，整合腫瘤細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)與腫瘤核心相比，EMThigh腫瘤細(xì)胞在腫瘤正常界面（腫瘤前緣）更富集，這反映了EMT狀態(tài)代表腫瘤細(xì)胞更具侵襲性的狀態(tài)（圖6C，6D）。然而，PT程序主要富集于腫瘤核心區(qū)域。使用cell2location算法，在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中PT/EMT程序的空間分布模式（圖6E、6F）。此外，作者發(fā)現(xiàn)TCGA分子亞型m3（預(yù)后差）顯示出顯著更高的EMT分?jǐn)?shù)，但PT分?jǐn)?shù)更低（圖6G）。

6. IL1B⁺巨噬細(xì)胞與高EMT 腫瘤細(xì)胞的空間相關(guān)性

作者使用NicheNet分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞來源的IL1B對這些EMT基因顯示出較高的調(diào)節(jié)潛力（圖7A），推測通過腫瘤細(xì)胞中表達的受體IL1R1。有趣的是，IL1B由富集在腫瘤正常界面處的TR Mac.2特異表達（圖5B 、5C）。并且在許多組織切片中發(fā)現(xiàn)，IL1B⁺巨噬細(xì)胞與EMThigh 腫瘤細(xì)胞的相關(guān)性最強（圖7B和7C）。

二．其他單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析文獻介紹

1. 單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示結(jié)直腸癌中FAP⁺成纖維細(xì)胞和SPP1⁺巨噬細(xì)胞的相互作用

Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP⁺ fibroblasts and SPP1⁺ macrophages in colorectal cancer于2022年4月發(fā)表在Nature Communication期刊上，作者通過整合分析scRNA-seq數(shù)據(jù)、公開發(fā)表的scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，證實FAP⁺成纖維細(xì)胞和SPP1⁺巨噬細(xì)胞的相互作用阻止T細(xì)胞浸潤，并發(fā)現(xiàn)FAP或SPP1高表達的患者在抗PD-L1治療隊列中獲得的治療益處較少。這一結(jié)果表明可以通過破壞FAP⁺成纖維細(xì)胞和SPP1⁺巨噬細(xì)胞的相互作用來改善免疫治療，提供了一種潛在的治療策略（圖8）。

2. 整合單細(xì)胞RNA測序與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示間質(zhì)性膀胱炎的免疫景觀

Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis于2022年5月發(fā)表在signal transduction and targeted therapy期刊上，該文章結(jié)合scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組進行了全面的表型和功能研究，構(gòu)建了間質(zhì)性膀胱炎（IC）膀胱組織免疫細(xì)胞圖譜（圖9）。

3.識別正常和腫瘤表型相關(guān)的細(xì)胞亞群

A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers于2021年9月發(fā)表在Nature genentics期刊，該文章作者開發(fā)了一種內(nèi)在亞型分類方法（SCSubtype）來揭示復(fù)發(fā)性腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性。對人類乳腺癌組織進行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，將其分為九類，稱為“生態(tài)型”，每一種“生態(tài)型”具有獨特的細(xì)胞組成和臨床結(jié)果（圖10）。

三．小編總結(jié)

目前scRNA-seq將每個基因與單個細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，但在組織中的位置信息卻丟失了；相反的，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)知道這些細(xì)胞的位置，卻不知道是哪個細(xì)胞表達了哪個基因。因此，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：優(yōu)勢互補，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行有效結(jié)合可以空間上繪制發(fā)育和疾病中的特定細(xì)胞亞群，并闡明這些細(xì)胞亞群協(xié)同形成組織表型的機制，提供嶄新的治療策略。