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生物有自己的作息規(guī)律，例如人們?nèi)粘龆魅章涠ⅲ鲜蟮葎t晝伏夜出，這些節(jié)律的本質(zhì)及運(yùn)作模式還未被全面研究，在2017年關(guān)于晝夜節(jié)律分子機(jī)制的研究就獲得了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。而晝夜節(jié)律與癌癥的關(guān)聯(lián)也越來(lái)越受到關(guān)注，小編今天就給大家分享一篇2022年8月發(fā)表在JOURNAL OF PINEAL RESEARCH (IF:13.007)雜志上使用公共數(shù)據(jù)研究節(jié)律紊亂與肺腺癌免疫微環(huán)境及預(yù)后關(guān)聯(lián)的單細(xì)胞分析文章。
Single‐cell transcriptomic analysis reveals circadian rhythm disruption associated with poor prognosis and drug‐resistance in lung adenocarcinoma
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示肺腺癌中晝夜節(jié)律紊亂與不良預(yù)后和耐藥有關(guān)
一．文章背景
晝夜節(jié)律是一種生物內(nèi)部計(jì)時(shí)系統(tǒng)，也被認(rèn)為是一種分子進(jìn)化機(jī)制，其會(huì)通過(guò)既定的生物鐘調(diào)控能量代謝和自身維持等多種生理過(guò)程。如今越來(lái)越多的證據(jù)表明，晝夜節(jié)律的紊亂(Circadian rhythm disruption, CRD)在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，并會(huì)促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。因此這篇文章使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)研究了肺腺癌中CRD與預(yù)后和耐藥的關(guān)聯(lián)。
二．文章摘要
研究開發(fā)了一個(gè)算法，并使用該算法對(duì)三個(gè)肺腺癌單細(xì)胞RNA - seq數(shù)據(jù)集中的晝夜節(jié)律紊亂狀態(tài)進(jìn)行了評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)高CRD評(píng)分的惡性細(xì)胞具有糖酵解和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化通路激活的特征。此外，細(xì)胞通訊分析也表明CRD在T細(xì)胞耗竭中起重要作用，這可能是導(dǎo)致惡性腫瘤預(yù)后不良的原因，研究也使用組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在22種癌癥中驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)。此外，Cox回歸分析表明CRD評(píng)分是有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物。研究也建立了一個(gè)包含23個(gè)晝夜節(jié)律基因的模型，該模型在14個(gè)獨(dú)立隊(duì)列都表現(xiàn)出良好的免疫應(yīng)答預(yù)測(cè)效能。同時(shí)，研究也觀察到細(xì)胞經(jīng)褪黑素處理后CRD評(píng)分會(huì)降低。
三．文章的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 惡性細(xì)胞的CRD與肺腺癌患者的進(jìn)展相關(guān)
在文章的第一部分，作者研究了惡性細(xì)胞CRD與肺腺癌患者進(jìn)展的關(guān)聯(lián)。
研究從公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲取30個(gè)腫瘤樣本（27個(gè)為原發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；3個(gè)接受了新輔助化療）。研究首先確定了12個(gè)樣本的臨床已知致癌驅(qū)動(dòng)基因(EGFR)突變情況，這些突變跨越了腫瘤進(jìn)展的不同階段(圖1A)，經(jīng)過(guò)質(zhì)控后保留了96 024個(gè)細(xì)胞，并將這些細(xì)胞聚成23個(gè)細(xì)胞群，并根據(jù)標(biāo)記基因?qū)⑵渥⑨尀閱魏思?xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞(圖1B)。
基于評(píng)估的拷貝數(shù)變異分離出惡性細(xì)胞，且觀察到惡性細(xì)胞的數(shù)量隨著癌癥分期的進(jìn)展而增加(圖1A)。惡性細(xì)胞具有樣本偏性(圖1B,C)，而非惡性細(xì)胞在患者之間沒有明顯差異(圖1B)。接下來(lái)，作者根據(jù)惡性細(xì)胞中2091個(gè)晝夜節(jié)律基因(CRGs)的表達(dá)進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)，識(shí)別出與樣本來(lái)源和TNM分期相關(guān)的包含358個(gè)CRGs的模塊(圖1D)，并對(duì)其進(jìn)行了功能注釋(圖1E)。
接著作者基于這些基因的表達(dá)對(duì)惡性細(xì)胞的CRD評(píng)分進(jìn)行了評(píng)估（圖1F）。CRD評(píng)分在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的樣本中較高；根據(jù)CRD評(píng)分將惡性細(xì)胞分為高和低CRD組，通路富集分析顯示糖酵解、G2M檢查點(diǎn)和MYC靶通路在高CRD組中富集(圖1G)。相比之下，DNA修復(fù)、p53和凋亡通路在化療后的樣本中更加明顯(圖1H)。
2. CRD與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療應(yīng)答相關(guān)
接下來(lái)文章研究了CRD與TKI治療應(yīng)答的關(guān)聯(lián)。研究對(duì)包含22例接受TKI治療患者的21 604個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集進(jìn)行了分析，根據(jù)時(shí)間點(diǎn)將樣本分為3組，分別為開始靶向治療前(TN)、完全或部分緩解(RD)狀態(tài)和疾病進(jìn)展(PD)狀態(tài)。研究將這些細(xì)胞注釋為免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞(圖2A)，然后使用inferCNV推斷出了4258個(gè)惡性細(xì)胞，接著比較TKI組間的細(xì)胞亞群分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞具有高度的TKI特異性，并且主要富集在PD樣本中(圖2B,C)。接著為了評(píng)估CRD對(duì)TKI治療的影響，研究基于358個(gè)節(jié)律基因的表達(dá)計(jì)算了惡性細(xì)胞的CRD評(píng)分(圖2B)，結(jié)果觀察到高CRD組的惡性細(xì)胞主要來(lái)自PD樣本(圖2D)。此外，轉(zhuǎn)移性和晚期患者的CRD評(píng)分也較高(圖2E)。接著研究根據(jù)CRD評(píng)分將22例患者分為高CRD組和低CRD組，結(jié)果觀察到高CRD患者的總體TKI應(yīng)答率顯著低于低CRD患者(圖2F,G)。接著研究根據(jù)CRD情況和TKIs結(jié)局(應(yīng)答vs.無(wú)應(yīng)答)分層進(jìn)行基因功能分析，其中GO分析顯示糖酵解、氧化磷酸化和自噬通路在伴高CRD的PD和TN患者中同時(shí)富集(圖2H)。此外，研究觀察到細(xì)胞因子分泌信號(hào)通路中主要在高CRD組中激活，與TKI結(jié)局無(wú)關(guān)(圖2I)。相反，在無(wú)應(yīng)答者(PD)和應(yīng)答者(RD)之間研究也觀察到糖酵解和細(xì)胞衰老信號(hào)的顯著差異(圖2I)，而葡萄糖和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因則在高CRD患者的惡性細(xì)胞中高表達(dá)(圖2G)，其中G6PD, HK2, ALOX5和DGKA的表達(dá)水平與CRD評(píng)分正相關(guān)(圖2J,K)。
3. CRD重塑了TME內(nèi)的細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性
這一部分作者對(duì)CRD與腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用進(jìn)行了分析。研究根據(jù)加權(quán)的輸入及輸出信號(hào)構(gòu)建了細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)，觀察到惡性細(xì)胞趨化因子的總體表達(dá)水平與CRD有關(guān)(圖3A)，且高CRD組具有顯著的抑制惡性細(xì)胞產(chǎn)生的共刺激信號(hào)(圖3B)，此外LGALS9、FAM3C和CD47等共抑制細(xì)胞因子也在高CRD細(xì)胞中顯著升高(圖3C)。研究還發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群與巨噬細(xì)胞之間的互作是由CCL20介導(dǎo)(圖3D)，且不同CDR組的M1和M2巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞表現(xiàn)出不同的共抑制和共刺激信號(hào)效應(yīng)(圖3E,F)。研究也發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)一組協(xié)同調(diào)節(jié)的受體配體會(huì)增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞與低CRD細(xì)胞的互作(圖3G,H)。接下來(lái)研究分析了CRD是否在單細(xì)胞水平調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)活性，結(jié)果如圖3I所示研究識(shí)別了在高CRD惡性細(xì)胞中被激活的36個(gè)細(xì)胞因子相關(guān)通路。進(jìn)一步研究也觀察到細(xì)胞因子信號(hào)在CRD高低組之間的差異激活會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)的協(xié)同調(diào)節(jié)效應(yīng)(圖3J)。
4. 使用組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集驗(yàn)證CRDscore的性能和魯棒性
這一部分研究使用組織數(shù)據(jù)對(duì)CRDscore的效能進(jìn)行了驗(yàn)證。研究首先在接受或未接受晝夜節(jié)律失調(diào)治療(CDT)的小鼠模型中收集了獨(dú)立的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果在3個(gè)CDT樣本的CRD評(píng)分高于正常樣本(圖4A)。此外，治療組CRD評(píng)分表現(xiàn)出與信號(hào)通路特征相關(guān)(圖4B)。接著研究使用ESTIMATE評(píng)估了TCGA中LUAD樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低CRD樣本中，免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的水平顯著高于CRD樣本。另一方面，腫瘤純度在CRD樣本中顯著富集(圖4C)。進(jìn)一步研究也觀察到CRD評(píng)分和Treg和Th2細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度之間正相關(guān)(圖4D)，研究在低CRD樣本中觀察到抗原呈遞和共刺激免疫調(diào)節(jié)普遍上調(diào)(圖4E)，而缺氧、EMT和糖酵解通路則在高CRD樣本中富集(圖4F)。
5. 在LUAD等多種癌癥中CRD與不良預(yù)后相關(guān)
這一部分研究在多個(gè)癌癥中分析了CRD評(píng)分與臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)。研究首先在5個(gè)獨(dú)立的LUAD隊(duì)列中構(gòu)建了平滑的總生存期(OS) HR曲線(圖5A-C)，并以CRD評(píng)分的截?cái)嘀底鳛閰⒖季€，結(jié)果觀察到CRD與OS有關(guān)。接著為了進(jìn)一步評(píng)估CRD評(píng)分的預(yù)后價(jià)值，研究使用Kaplan-Meier生存分析比較了不同CRD評(píng)分組之間的OS(圖5D-F)。在LUAD隊(duì)列中，研究觀察到高CRD患者的OS明顯差于低CRD患者。進(jìn)一步的亞組分析也表明所有樣本中，CRD高低組的OS存在顯著差異(圖5G)，表明CRD評(píng)分是有價(jià)值的肺腺癌預(yù)后指標(biāo)。此外，研究也分析了來(lái)自TCGA的包括乳腺癌(BRCA)和前列腺癌(PRAD)在內(nèi)的22種癌癥的7500多例樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRD評(píng)分在大多數(shù)癌癥類型中的分布相似(圖5H)。然后，研究以評(píng)分的中位數(shù)為閾值，將所有患者分為CRD高低組(圖5I)，觀察到腫瘤樣本中的CRD評(píng)分顯著高于鄰近正常組織(圖5J)。同時(shí)，在LUAD、胰腺癌(PAAD)、間皮瘤(MESO)和葡萄膜黑色素瘤(UVM)等四種癌癥類型中，高CRD患者的單因素和多因素生存模型均與更差的預(yù)后相關(guān)(圖5K)。
6. 構(gòu)建一個(gè)預(yù)測(cè)ICB免疫治療應(yīng)答的晝夜節(jié)律相關(guān)模型
接下來(lái)研究在兩個(gè)獨(dú)立的接受化療的LUAD隊(duì)列中檢驗(yàn)了CRD評(píng)分預(yù)測(cè)免疫應(yīng)答的能力。研究觀察到低CRD患者的治療效果顯著較好，其5年生存率是高CRD患者的2倍以上(圖6A,B)。此外，CRD評(píng)分可以評(píng)估NSCLC患者的TKI應(yīng)答，如圖6C所示與低CRD患者相比，高CRD與顯著較差的無(wú)進(jìn)展生存期有關(guān)。研究還通過(guò)預(yù)測(cè)BRCA患者對(duì)化療的反應(yīng)來(lái)評(píng)估CRD得分的性能(圖6D)，結(jié)果在接受化療的BRCA隊(duì)列中，CRD評(píng)分在分類方面表現(xiàn)良好(圖6D)。接著研究根據(jù)突變特征將LUAD樣本分層為時(shí)鐘樣或非時(shí)鐘樣亞型，結(jié)果觀察到時(shí)鐘樣信號(hào)與LUAD患者的OS沒有顯著相關(guān)性(圖6E)，接著研究將患者分為“clock‐like mut&高CRD”和“non‐clock‐like mut&低CRD”組，結(jié)果觀察到“clock‐like mut&高CRD”組患者的生存率顯著低于另一組(圖6E)。接下來(lái)研究基于358個(gè)CRG表達(dá)譜，使用LASSO和SVM‐RFE算法識(shí)別了包含23個(gè)CRG的基因集(圖6F)，并構(gòu)建了一個(gè)基于五倍交叉驗(yàn)證的廣義線性回歸模型(CRGm)來(lái)預(yù)測(cè)14個(gè)獨(dú)立的癌癥隊(duì)列的治療應(yīng)答。結(jié)果在所有隊(duì)列中觀察到應(yīng)答(RD)樣本的CRGm預(yù)測(cè)指數(shù)均高于無(wú)應(yīng)答(NR/PD)樣本(圖6G)。此外，作者將CRGm的性能與其他已發(fā)表的基于mRNA表達(dá)的免疫治療應(yīng)答預(yù)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了比較 ，結(jié)果觀察到CRGm的總體性能比其他預(yù)測(cè)指標(biāo)更穩(wěn)健和準(zhǔn)確(圖6H-J)。
7. 褪黑素可以減弱CRD和癌細(xì)胞的侵襲性
最后一部分研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證CRD與癌癥的關(guān)聯(lián)。研究首先使用RT - qPCR檢測(cè)了兩個(gè)NSCLC細(xì)胞系(A549和H1299)和一個(gè)支氣管上皮細(xì)胞系BEAS - 2B中晝夜節(jié)律核心基因的表達(dá)變化，結(jié)果觀察到CLOCK在H1299細(xì)胞中表達(dá)顯著增加(圖7A)。接著研究檢測(cè)了癌細(xì)胞的侵襲性，使用siRNA (siCLOCK)敲除CLOCK或褪黑素預(yù)處理后，觀察到細(xì)胞侵襲性受損(圖7B)。接著研究通過(guò)RNA測(cè)序評(píng)估了基因表達(dá)模式，結(jié)果識(shí)別基因的PCA展示治療組明顯聚類，且褪黑素組的差異遠(yuǎn)大于siCLOCK組(圖7C，D)。接著研究對(duì)差異表達(dá)基因的GO分析揭示了接受抗CRD處理的細(xì)胞與晝夜節(jié)律、能量穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)(圖7E)。研究也觀察到CRD評(píng)分與EMT標(biāo)志物之一的SNAIL的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(圖7F)，此外CRD評(píng)分和SNAIL的蛋白水平可以被褪黑素顯著抑制(圖7G)，表明CRD狀態(tài)和癌細(xì)胞的侵襲能力被這種抗CRD處理減弱。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了，研究使用單細(xì)胞及組織數(shù)據(jù)，計(jì)算了腫瘤的節(jié)律紊亂得分，并分析了其對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境通訊、臨床結(jié)局及免疫應(yīng)答等的影響，對(duì)節(jié)律與癌癥的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了全面分析，內(nèi)容豐富，邏輯清晰，有理有據(jù)，十分值得我們參考。
