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基于驅(qū)動基因突變對肝內(nèi)膽管癌聚類，得到具有明顯的分子特征和治療脆弱性的臨床相關(guān)的類群
背景介紹
膽管癌是指膽管上皮細(xì)胞惡性增殖，形成的腫瘤。主要分為3種類型：肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌和肝外膽管癌。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（ICC）又叫膽管細(xì)胞性肝癌，它在解剖學(xué)上與肝外膽管癌(ECC)不同，是僅次于肝細(xì)胞肝癌（HCC）的第二大常見原發(fā)性肝惡性腫瘤，發(fā)生率約10～15%，男性略大于女性。具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，大部分ICC患者都在癌癥晚期時(shí)才被診斷出。外科手術(shù)是ICC的首選治療方法。目前對ICC的病因尚不完全清楚，可能與肝內(nèi)膽管結(jié)石，病毒性肝炎、2型糖尿病(T2DM)、肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、先天性膽道畸形等有關(guān)。此外，寄生蟲感染（肝吸蟲?。⒂卸居泻ξ镔|(zhì)的暴露、代謝異常（糖尿病和肥胖）也被認(rèn)為是肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素。部分ICCs來源于大膽管的成熟膽管細(xì)胞，與ECC主要相似;而其他亞型來源于黑林管的小膽管或祖細(xì)胞，甚至具有HCC的某些特征。其病因和細(xì)胞來源的多樣性表明ICC腫瘤發(fā)生的復(fù)雜機(jī)制。因此，迫切需要建立一套有效的ICC臨床分類系統(tǒng)。
基因組學(xué)特征層面而言，TP53、KRAS和SMAD4突變已被確定為東方國家ICCs患者中最多的突變，主要病原包括流行肝吸蟲、病毒性肝炎和肝內(nèi)膽管結(jié)石。相反，患者中 IDH1/2、BAP1、PBRM1突變和FGFR2融合情況在西方國家更為普遍。從遺傳學(xué)角度來說，驅(qū)動基因突變之間存在潛在的功能依賴網(wǎng)絡(luò)，具有潛在的生物學(xué)和臨床影響。迄今為止，人類癌癥的大規(guī)?；驁D譜提供了證據(jù)，證明了特定致癌基因突變之間共發(fā)和互斥的非隨機(jī)模式，這為癌癥發(fā)展提供了深刻的啟示。
數(shù)據(jù)情況
1. 突變數(shù)據(jù)
研究隊(duì)列：2013-2020年期間發(fā)表的24篇相關(guān)文獻(xiàn)中的805例ICC患者數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)類型主要有STS、WGS和WES三種。
內(nèi)部驗(yàn)證集：225例ICC患者，包括腫瘤分期信息。
獨(dú)立ICC隊(duì)列：包括一個(gè)212例來自MSKCC的ICCs和158例來自cbioportal數(shù)據(jù)集的ICCs隊(duì)列和一個(gè)TIGER-LC和ICGC中的239例ICCs隊(duì)列。
生存分析數(shù)據(jù)集：來自TCGA和ICGC中的178例ECCs。
2. 基因表達(dá)數(shù)據(jù)：9個(gè)CCA的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。
3. 甲基化數(shù)據(jù)集（450K）：GSE32079、GSE49656和GSE89803
結(jié)果
1. ICC中驅(qū)動基因突變的概覽
首先作者在圖1A中展示了本研究整體的一個(gè)流程設(shè)計(jì)。在本研究中，通過對505例WES/WGS和300例STS數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，有22個(gè)基因在至少70%的樣本中突變頻率大于2%。其中突變頻率最高的基因是TP53、KRAS、IDH1/2、ARID1A、 BAP1、PBRM1、FGFR2 融合、CDKN2A、SMAD4、PIK3CA和EPHA2(突變頻率> 5%)。所有這些基因都進(jìn)行了一系列相關(guān)性的檢驗(yàn)（如圖1B）。最后，在21個(gè)突變基因組合中發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的突變基因?qū)?共同出現(xiàn)或互斥)，包括12個(gè)正相關(guān)和9個(gè)負(fù)相關(guān)(圖1C-D)。
2. 通過七個(gè)驅(qū)動基因的成對相關(guān)性定義三個(gè)突變?nèi)?/strong>
接下來，研究人員根據(jù)7個(gè)基因(TP53、KRAS、SMAD4、IDH1/2、FGFR2融合和BAP1)的高突變頻率和強(qiáng)成對相關(guān)性提出一個(gè)新的聚類方式。Cluster1至少有一個(gè)KRAS/TP53/SMAD4突變;至少有一個(gè)IDH/FGFR2-fus/BAP1突變且沒有KRAS/TP53/SMAD4突變的為Cluster2；而在Cluster3中上述基因均為野生型。根據(jù)上述策略，利用研究隊(duì)列中505例樣本的WES/WGS數(shù)據(jù)對堂本進(jìn)行聚類。167例(33.1%)和117例(23.2%)分別攜帶Cluster1和Cluster2突變，同時(shí)這兩類之間具有很強(qiáng)的互斥性。具體所有的樣本的聚類情況如圖1D所示。
3. 在其他隊(duì)列中驗(yàn)證聚類方式的可靠性
為了證明上述聚類方式是穩(wěn)定可靠的，研究人員又將這種方式應(yīng)用到了其他樣本數(shù)據(jù)中。在研究隊(duì)列的STS數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)了Cluster1突變和Cluster2突變也傾向于相互排斥，同時(shí)，Cluster1和Cluster2基因的突變頻率分別為36.9%(97/263)和27.8%(73/263)。此外，他們在另外三個(gè)隊(duì)列中也得到了類似的效果。
4. 臨床因素對Cluster1和Cluster2突變互斥性的影響
既然本文的研究對象是臨床相關(guān)的腫瘤病人，那么通過上述聚類方式得到的cluster的臨床特征又是什么樣的呢？研究發(fā)現(xiàn)，Cluster1和Cluster2突變在不同性別(男性/女性)、年齡(≥65 / < 65)和病因之間具有相似的互斥優(yōu)勢比(ORs)。值得注意的是，腫瘤分期對Cluster1和Cluster2突變的互斥性影響最大。III/IV期患者Cluster1和Cluster2突變的OR比I/II期患者高出3倍以上。在這些樣本中，有16例具有臨床分期信息的病例是Cluster1/2共突變類型的，其中14例為III/IV期(87.5%)，這明顯高于僅具有Cluster1突變(66.2%)或Cluster2突變(55%)的病例。研究人員推測這種罕見的Cluster1/2共突變模式可能是腫瘤進(jìn)化的結(jié)果。
5. 不同的突變?nèi)罕憩F(xiàn)出不同的臨床病理特征
其次，研究人員比較了不同聚類的臨床病理特征。Cluster1突變在東方人群中更常見，而Cluster2突變在西方人群中更常見(圖2A)。從病因角度來說，Cluster2多見于無明確危險(xiǎn)因素的ICCs和病毒性肝炎相關(guān)的ICCs，但在肝吸蟲感染或肝結(jié)石病例中很少發(fā)現(xiàn)。而Cluster1A和Cluster1B在病毒性肝炎、肝吸蟲感染和肝內(nèi)結(jié)石等肝病病例中更常見(圖2B)。在圖2C中可以看到轉(zhuǎn)移性病例中Cluster1突變顯著富集。在原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間，Cluster2突變的頻率相似，而Cluster3突變在原發(fā)性腫瘤中比轉(zhuǎn)移性腫瘤中更普遍。此外，Cluster1A ICCs的CA19-9水平最高，而Cluster2 ICCs的CA19-9水平遠(yuǎn)低于Cluster1A和Cluster1B(圖2D)。與其他cluster相比，Cluster1A的ICCs在III/IV期患者中更富集(圖2E)。
根據(jù)組織學(xué)形態(tài)分類，ICC可分為小膽管型和大膽管型。因此研究人員還關(guān)注了內(nèi)部驗(yàn)證隊(duì)列中的94例ICC病例的不同突變cluster的組織學(xué)表型。值得注意的是，大多數(shù)Cluster1型ICCs，特別是Cluster1A型ICCs的組織形態(tài)主要表現(xiàn)為大膽管，而Cluster2型ICCs主要表現(xiàn)為小膽管(圖2F)。
6. 不同突變?nèi)旱腎CCs表現(xiàn)出不同的臨床特征
如圖3A所示，Cluster1突變與較差的總生存期(OS)和無復(fù)發(fā)生存期(RFS)顯著相關(guān)。相比之下，Cluster2突變的病例與Cluster3 ICCs相比，Cluster2的RFS相似，但OS相對較長。在Cluster1病例中，Cluster1A和1B ICC病例的預(yù)后同樣較差。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)Cluster1突變狀態(tài)在手術(shù)切除的ECS中沒有顯示顯著的預(yù)后價(jià)值。這表明觀察到的突變cluster的預(yù)后價(jià)值可能是ICC特異性的。
然后，研究人員還研究了不同突變cluster在接受治療的晚期ICCs中的預(yù)后價(jià)值。在來自MSKCC隊(duì)列的104例接受治療的轉(zhuǎn)移性/復(fù)發(fā)性ICCs中，與Cluster2/3的患者相比，Cluster1的患者在治療中進(jìn)展率更高，OS相對更差，盡管其生存差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C)。
7. Cluster1突變與侵襲性和預(yù)后不良相關(guān)分子特征有關(guān)
分析完組織樣本數(shù)據(jù)，為了研究突變cluster之間預(yù)后差異，研究人員還分析了15個(gè)膽管癌細(xì)胞系的突變情況。利用基于238個(gè)基因富集評分的監(jiān)督聚類方式，可以在5個(gè)獨(dú)立的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集中將膽管癌病例分為3組 (圖3D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cluster1的ICCs和ECC病例大多富集在“預(yù)后不良”亞型，而Cluster2的ICCs大多集中在“預(yù)后良好”亞型。
8. 不同的突變?nèi)罕憩F(xiàn)出不同的組織學(xué)和譜系相關(guān)的分子特征
利用目前已報(bào)道的膽管細(xì)胞分化基因表達(dá)標(biāo)記(CD標(biāo)記)，可以將CCA樣本分成不同的三種CD表型(圖4A)。大多數(shù)Cluster2的ICCs屬于CD亞型，而Cluster1的ICCs和ECCs大多聚為非CD表型或混合表型(圖4A)。利用肝干細(xì)胞樣(HpSC)基因表達(dá)特征可以在上述三個(gè)隊(duì)列中將CCAs進(jìn)一步分為三種亞型 (圖4B)。大多數(shù)Cluster2型ICC病例富集于HpSC亞型，而Cluster1型ICC和ECCs多分為非HpSC或混合表型。在DNA甲基化層面研究發(fā)現(xiàn)Cluster2的ICCs表現(xiàn)出明顯高于Cluster1的ICCs的DNA甲基化水平，在Cluster2的ICCs中，F(xiàn)GFR2融合或BAP1突變的ICCs(沒有IDH1/2突變)與IDH突變的ICCs表現(xiàn)出相似的DNA甲基化模式(圖4C)。此外研究人員還發(fā)現(xiàn)了不同的致癌基因表達(dá)標(biāo)記在不同的cluster中。例如Cluster1在ICC中顯示了一系列此前已報(bào)道的轉(zhuǎn)移或進(jìn)展相關(guān)基因的最高表達(dá)水平，如TMPRSS4、S100A4、S100P、PTEGS、MUC1、COX-2、IL-6和CEACAM6。
9. IDH/FGFR2融合/BAP1和TP53/SMAD4共突變模式進(jìn)一步定義了兩種預(yù)后不同的HCC亞型
根據(jù)目前的研究報(bào)道，HCC、ICC和CHC這三種最常見的原發(fā)性肝癌(PLC)亞型有時(shí)會表現(xiàn)出重疊表型，如膽管癌樣HCC (CLHCC)亞型。使用CCA-like特征(CC signature)可以將407個(gè)TCGA-PLC(373個(gè)HCC、36個(gè)CCA和10個(gè)CHC)隊(duì)列分為一個(gè)連續(xù)性的肝癌譜系。其中175例HCC/CHC病例顯示類似CCA的特征，并與36例CCA病例聚集在一起，表明它們本質(zhì)上與CCA分子特征相似(圖5A)。與之前的研究一致，CCA、CLHCC和經(jīng)典HCC的預(yù)后不同(圖5B)。譜系特異性標(biāo)志物(EPCAM、CD133、KRT19、CEACAM6、HNF4A和ALB)在這三種亞型中也是差異表達(dá)的(圖5C)。與分化良好的HCC的組織學(xué)形態(tài)相比，這些CLHCCs的顯微鏡下特征表現(xiàn)為“CCA-like型”(圖5D)。同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)TP53/SMAD4突變和IDH/FGFR2-fus/BAP1突變的百分比顯著升高，而CTNNB1在CLHCC亞型中的突變率低于經(jīng)典HCC亞型(圖5A)。與ICC一致，這兩類cluster也傾向于相互排斥(圖5E)，與Cluster2 CLHCCs相比，Cluster1B CLHCCs的OS和RFS也明顯更短(圖5F)。
10. 具有不同聚類突變的ICC細(xì)胞對分子靶向治療表現(xiàn)出不同的敏感性
考慮到Cluster1和Cluster2 ICCs之間的分子差異，研究人員認(rèn)為比較它們對分子靶向治療的響應(yīng)可能也是不一樣的。一共篩選了六種ICC細(xì)胞系(包括兩種Cluster1A:兩種Cluster1B和兩種Cluster2A突變細(xì)胞系)進(jìn)行研究。細(xì)胞活性檢測表明，沒有化合物可以選擇性地降低Cluster1A和1B突變ICC細(xì)胞的活性(圖6A)。與Cluster1A突變細(xì)胞相比，Cluster2A突變ICC細(xì)胞對Dasatinib、Vorinostat、JQ1、iBET、Olaparib和Niraparib表現(xiàn)出更高的敏感性(圖6A-B)。同時(shí)，JQ1和Vorinostat顯著抑制Cluster2A (IDH1突變)ICC細(xì)胞，但不抑制Cluster1A (KRAS/TP53突變)ICC細(xì)胞（圖6C）。這項(xiàng)分析表明，ICCs的分子亞型可能與特定靶向治療的獨(dú)特敏感性有關(guān)。研究人員還指出，基于ICC不同突變cluster的更大規(guī)模藥物篩選值得進(jìn)一步研究。
11. 結(jié)合基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選ICCs的特異性生物標(biāo)志物
綜上所述，Cluster1A和Cluster2 ICCs具有明顯的臨床特征。通過比較這兩類的基因表達(dá)數(shù)據(jù)得到了52個(gè)明顯差異表達(dá)的基因。在這些基因中，前兩個(gè)基因S100P和KRT17都是CCA生存特征和ICC復(fù)發(fā)特征的預(yù)后標(biāo)記，同時(shí)也是CD特征的標(biāo)記(圖7A)。研究人員構(gòu)建了一個(gè)臨床病理評分(CP評分)系統(tǒng)，CP分?jǐn)?shù)低(0和1)可以很好地定義Cluster2的ICCs，而Cluster1的ICCs大多富集于CP分?jǐn)?shù)高的組中(圖7B)。該評分系統(tǒng)還可以將Cluster3病例分為兩個(gè)具有明顯臨床和生物學(xué)相關(guān)性的亞群（圖7C-D）。
總而言之，S100P和KRT17結(jié)合CA19-9可能作為譜系指示標(biāo)記，有助于ICC突變cluster的鑒別。結(jié)合聚類突變和亞型特異性的生物標(biāo)志物，研究人員最終提出了一種臨床適用的聚類策略，它可以指導(dǎo)ICC預(yù)后分層、分子分類和治療優(yōu)化(圖8)。
結(jié)論
在本研究中，研究人員通過研究驅(qū)動基因突變的成對相關(guān)性或互斥性，揭示了ICC多樣性的突變基礎(chǔ)?？偠灾?，研究人員人員對篩選出的7個(gè)突變基因的進(jìn)行突變檢測，結(jié)合S100P/KRT17表達(dá)和CA19-9水平的評估，是鑒定臨床和生物學(xué)上不同亞型ICC的可靠生物標(biāo)志物。此外，他們還發(fā)現(xiàn)不同的突變cluster具有不同的腫瘤發(fā)生機(jī)制，因此藥物反應(yīng)性也不同，這將為惡性腫瘤的治療提供更精確的治療策略。
