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大家好呀，今天讓我們來(lái)看一篇題為轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞分析揭示免疫抑制微環(huán)境在促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展中的貢獻(xiàn)文章，文章于今年一月發(fā)表在《Frontiers in Immunology》（IF =8.786）上，讓我們來(lái)一起學(xué)習(xí)一下吧！
一、摘要
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）患者經(jīng)常表現(xiàn)出嚴(yán)重的局部和全身免疫抑制，限制了免疫治療策略的療效。GBM腫瘤免疫抑制機(jī)制的建立是個(gè)體化免疫治療成功的關(guān)鍵。本研究成功地發(fā)現(xiàn)了GBM的免疫抑制亞型及其形成的主要細(xì)胞類(lèi)型、信號(hào)通路和分子，為今后改進(jìn)GBM的個(gè)性化免疫治療提供了新的線(xiàn)索。
二、技術(shù)路線(xiàn)
A、通過(guò)對(duì)TCGA-GBM和CGGA隊(duì)列基因共存、高危組和低危組得到的DEGs以及IDH1突變與野生型的比較等三個(gè)角度獲得的基因集進(jìn)行功能富集分析，確定了與GBM患者預(yù)后不良相關(guān)的五個(gè)途徑。
B、構(gòu)建GBM與腫瘤微環(huán)境（TME）相關(guān)的功能基因標(biāo)簽。根據(jù)這些特征的活性分布，將GBM患者分為四個(gè)不同的亞型，并發(fā)現(xiàn)免疫抑制亞型。
C、在三個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證免疫抑制亞型的Hub基因表達(dá)，并確定了與其顯著相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型、某些細(xì)胞類(lèi)型之間的相互作用。（圖1）
三、結(jié)果
1、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用是GBM的危險(xiǎn)因素
作者對(duì)所有基因進(jìn)行單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，在TCGA-GBM隊(duì)列和CGGA隊(duì)列分別發(fā)現(xiàn)了1264、2681個(gè)基因與生存相關(guān)。取交集共86個(gè)基因，KEGG富集結(jié)果皆被前人證實(shí)過(guò)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因在GBM進(jìn)展中的預(yù)測(cè)作用，作者基于最小絕對(duì)收縮篩選得到8個(gè)基因并使用LASSO回歸構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型。高危組患者預(yù)后較低危組差，模型預(yù)測(cè)患者生存期的AUC值在1年、3年和5年均大于0.75，表明風(fēng)險(xiǎn)模型具有較高的預(yù)測(cè)能力。在TCGA-GBM隊(duì)列中計(jì)算高、低危險(xiǎn)組之間的差異表達(dá)基因（DEGs）并進(jìn)行KEGG富集，其中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用是最重要的途徑。與野生型患者相比，異檸檬酸脫氫酶(IDH1)基因在GBM患者中是一個(gè)復(fù)發(fā)性突變與良好的預(yù)后結(jié)果有關(guān)。上述高危患者中富集的、上調(diào)的通路在IDH1突變樣本中下調(diào)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了他們?cè)贕BM中的促腫瘤特性。有趣的是，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用再次位于IDH1突變和野生型患者之間富集通路的頂端。（圖2）
2、異質(zhì)性的腫瘤微環(huán)境（TME）成分與促腫瘤途徑相關(guān)
TME由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、白細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。為了對(duì)TME進(jìn)行分類(lèi)，作者構(gòu)建了代表腫瘤主要功能成分和免疫、間質(zhì)及其他細(xì)胞群體的基因表達(dá)簽名(GES)。根據(jù)生物學(xué)背景知識(shí)從高危患者的上述上調(diào)通路中篩選出5條促瘤通路。分析5條通路與其他TME信號(hào)（如MDSC和單核細(xì)胞的基因表達(dá)標(biāo)簽GES）的相關(guān)性，5條促瘤通路與其他促腫瘤或血管生成相關(guān)信號(hào)呈顯著正相關(guān)，與抗腫瘤相關(guān)信號(hào)呈顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)對(duì)這些TME相關(guān)特征的單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)特征具有高HR。綜上所述，作者綜合分析了GBM的TME基因特征，發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性的TME成分與腫瘤促進(jìn)途徑有關(guān)。
3、GES分類(lèi)識(shí)別GBM免疫抑制亞型
根據(jù)所選GES在TCGA-GBM數(shù)據(jù)集中的表達(dá)活性，采用層次聚類(lèi)方法將患者分為4個(gè)亞型并根據(jù)腫瘤進(jìn)展(P)、免疫浸潤(rùn)(IE)和兩者同時(shí)表達(dá)(P/IE)對(duì)亞型進(jìn)行定義。P亞型有較高的腫瘤進(jìn)展特征和較低的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，存活率最差。然后作者從免疫抑制、免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）、高頻突變分布、細(xì)胞浸潤(rùn)等幾個(gè)方面評(píng)價(jià)了IE和P亞型之間的差異。圖3C繪制了免疫抑制因子的表達(dá)熱圖，可以看到這些基因在亞型P中高表達(dá)；圖3D繪制了四個(gè)亞型高頻突變的分布，IDH1突變?yōu)镮E型具有較好的臨床結(jié)局與上述結(jié)果一致。腫瘤細(xì)胞通常上調(diào)ICB基因表達(dá)以逃避免疫系統(tǒng)。圖3E繪制了抑制性ICB在P型細(xì)胞中的表達(dá)。P亞型表現(xiàn)為高水平的髓系細(xì)胞浸潤(rùn)，其他亞型表現(xiàn)為高水平的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3F）。使用CGGA數(shù)據(jù)集驗(yàn)證結(jié)果與上述一致，不一致的是CGGA數(shù)據(jù)集中IDH突變不主要分布在IE型，也分布在IE/P型?？傊?strong>作者在TCGA-GBM和CGGA隊(duì)列中鑒定了免疫抑制亞型和淋巴細(xì)胞亞型，并發(fā)現(xiàn)了它們相反的生物學(xué)特性。（圖3）
4、GBM亞型代表了異質(zhì)性的功能基因模塊
使用WGCNA識(shí)別亞型特異的功能模塊，計(jì)算模塊基因與亞型之間的相關(guān)性，P亞型特異的模塊為7、5和18；IE/P2亞型特異模塊為113；IE/P1亞型特異的模塊為10；IE亞型特異模塊為15、8和11。對(duì)亞型特異性模塊進(jìn)行功能富集分析并依據(jù)P值篩選每個(gè)模塊的前5條途徑。M5富含參與炎癥反應(yīng)的基因，包括細(xì)胞因子相互作用、趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)和Th17細(xì)胞分化。M7富含與血管生成相關(guān)的基因。M18富含參與細(xì)胞對(duì)低氧反應(yīng)和碳代謝的基因。提示這三種功能相關(guān)的基因參與了免疫抑制微環(huán)境的形成。IE/P2和IE/P1亞型均與代謝有關(guān)。IE亞型主要富集于突觸和單一轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路，這表明IE亞型的神經(jīng)系統(tǒng)活性較高。
單因素Cox回歸分析各模塊基因表達(dá)與患者生存的關(guān)系。P<0.05、HR>1促腫瘤相關(guān)基因，HR<1抗腫瘤相關(guān)基因。促腫瘤基因比例>0.5預(yù)后不良相關(guān)模塊，抗腫瘤相關(guān)基因比例>0.5預(yù)后相關(guān)模塊。將9個(gè)亞型特異性模塊分為7個(gè)預(yù)后不良模塊和2個(gè)預(yù)后良好模塊，各亞型特異性模塊的存活相關(guān)基因縮寫(xiě)為ssMSGs，對(duì)hub基因進(jìn)行生存分析得到主要位于M5和M7(P亞型）的24個(gè)hub基因。通過(guò)對(duì)Hub基因在不同基因模塊中的共表達(dá)分析，確定了M5中前15個(gè)Hub基因包括LAPTM5、NCKAP1L、PTPN5、SYX和SIGLEC9，這與我們總結(jié)的危險(xiǎn)通路一致。此外，在免疫治療隊(duì)列中這15個(gè)hub基因的特征與較差的臨床結(jié)果相關(guān)（圖4f），與M5的促瘤功能一致。值得注意的是，在單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中，我們證實(shí)M5、M7和M15的hub基因也是特定細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因。M5中的CSTS、CD68、NOD2是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物；M7中COL6A2和ITGA5與血管細(xì)胞有關(guān)；M15中的Oligo2是少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。這一結(jié)果表明，在GBM的發(fā)展過(guò)程中，特異的細(xì)胞類(lèi)型應(yīng)該代表不同的功能模塊。（圖4）
5、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞操縱GBM促瘤基因模塊
作者分析了3個(gè)GBM單細(xì)胞數(shù)據(jù)集(GSE117891、GSE84465和GSE163120)中9個(gè)亞型特異模塊ssMSGs的表達(dá)活性。用“AUCcell”計(jì)算單細(xì)胞中ssMSGs的表達(dá)活性。在P亞型相關(guān)基因中：M5在髓系細(xì)胞包括TAMS、小膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞和DCs中高表達(dá)；M7主要在血管中表達(dá)；M18在血管、髓細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)。IE亞型相關(guān)基因位于OPCs和神經(jīng)元。結(jié)合這些結(jié)果，我們認(rèn)為巨噬細(xì)胞操縱M5，血管相關(guān)細(xì)胞參與M7，而OPC細(xì)胞調(diào)節(jié)M15。（圖5A-D）
6、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用
作者比較了腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的相互作用強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在所有細(xì)胞類(lèi)型中巨噬細(xì)胞都表現(xiàn)出與腫瘤細(xì)胞的高度相互作用；作者同時(shí)繪制了免疫細(xì)胞之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。有趣的是，當(dāng)我們通過(guò)細(xì)胞因子相關(guān)途徑的表達(dá)來(lái)劃分細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)更高細(xì)胞因子途徑的巨噬細(xì)胞與DC和T細(xì)胞的相互作用更強(qiáng)，這可能強(qiáng)調(diào)了它們的促腫瘤機(jī)制。類(lèi)似地，我們發(fā)現(xiàn)具有較高細(xì)胞因子途徑表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞傾向于與DC，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用。Tregs與細(xì)胞因子高的亞型之間的相互作用更強(qiáng)，這可以重塑免疫抑制微環(huán)境?？傊覀兇_定了在GBM中操縱不同基因模塊的特定細(xì)胞類(lèi)型，主要關(guān)注巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞與微環(huán)境中其他細(xì)胞類(lèi)型的相互作用。（圖5E-F)
7、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)與Tregs相互作用形成免疫抑制微環(huán)境
為了進(jìn)一步確定GBM患者巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)，基于配體-受體對(duì)的表達(dá)和下游靶點(diǎn)，作者選擇Tregs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)粘附配體-受體對(duì)ICAM1-IL2RG和ITGAM-ICAM2直接接觸Tregs。此外，巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)EBI3、CD86和TNF的表達(dá)增強(qiáng)Tregs的活化因子活性，誘導(dǎo)Tregs表達(dá)IL27RA、CD28、TNFRSF1B、Fas、ICOS和免疫檢查點(diǎn)CTLA4。 巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)CXCL16-CXCR6、CCL3-CCR5、CCL2-CCR5對(duì)增強(qiáng)Tregs的募集。然后作者評(píng)估了巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞上的哪些配體最有可能調(diào)節(jié)Tregs，合并GSE163120和GSE117891數(shù)據(jù)集確定了七個(gè)配體基因。圖6d展示了前15個(gè)hub基因與這些配體之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 SPI1可能是TNF的上游調(diào)節(jié)因子，GPSM3可能調(diào)節(jié)C3、CXCL3、CXCL16和CXCL2等一系列細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)?？傊?，作者發(fā)現(xiàn)上游調(diào)節(jié)因子是如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上配體的表達(dá)的，配體是如何與Tregs上的受體相互作用的，以及這些相互作用如何形成GBM的免疫抑制微環(huán)境。（圖6）
三、小結(jié)
本篇文章結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞數(shù)據(jù)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤劃分亞型，并成功地定義了免疫抑制亞型，不同類(lèi)型患者的生存率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本文有4個(gè)亮點(diǎn)：1、作者構(gòu)建了代表腫瘤主要功能成分和免疫、間質(zhì)及其他細(xì)胞群體的基因表達(dá)簽名(GES)，并利用GES進(jìn)行亞型的劃分。2、使用WGCNA分析對(duì)亞型功能及形成機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)充。3、在單細(xì)胞驗(yàn)證集中，作者利用“AUCcell”評(píng)估各亞型特異性模塊的生存相關(guān)基因活性評(píng)分，觀察這些基因在哪些細(xì)胞中表達(dá)升高，從而將細(xì)胞類(lèi)型與功能模塊相聯(lián)系。4、作者通過(guò)對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析揭示了GBM的免疫抑制微環(huán)境的形成機(jī)制。文章脈絡(luò)清晰，得到的結(jié)論可前后相互印證，感興趣的小伙伴可以進(jìn)行復(fù)現(xiàn)嘗試哦~
參考文獻(xiàn)：Ni L, Sun P, Zhang S, Qian B, Chen X, Xiong M, Li B. Transcriptome and single-cell analysis reveal the contribution of immunosuppressive microenvironment for promoting glioblastoma progression. Front Immunol. 2023 Jan 5;13:1051701. doi: 10.3389/fimmu.2022.1051701 . PMID: 36685556; PMCID: PMC9851159.
