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今天跟大家分享的是發(fā)表在Nature（IF: 49.962）上的一篇文章。T細(xì)胞浸潤(rùn)程度對(duì)免疫治療響應(yīng)有關(guān)鍵作用，在本篇文章中，研究者提出一種基于DNA測(cè)序估計(jì)T細(xì)胞分?jǐn)?shù)的方法。T細(xì)胞受體切除環(huán)（TRECs）的缺失是T細(xì)胞成熟所需要的，其通常在V(D)J重組過程中會(huì)發(fā)生；通過對(duì)TRECs的缺失打分，研究人員就能準(zhǔn)確估計(jì)出腫瘤中存在的T細(xì)胞數(shù)量；這個(gè)分?jǐn)?shù)還能被用來預(yù)測(cè)患者對(duì)檢查點(diǎn)抑制劑（CPIs）的響應(yīng)以及免疫逃逸機(jī)制。
Using DNA sequencing data to quantify T cell fraction and therapy response
基于用DNA測(cè)序數(shù)據(jù)量化T細(xì)胞分?jǐn)?shù)和治療反應(yīng)
1.從全外顯子測(cè)序（WES）數(shù)據(jù)推斷T細(xì)胞分?jǐn)?shù)
T細(xì)胞多樣性是免疫系統(tǒng)識(shí)別外來抗原所必需的，是V(D)J重組的產(chǎn)物（T細(xì)胞受體基因片段重組）。T細(xì)胞受體的α-鏈?zhǔn)怯蒚CRA基因編碼的，V(D)J重組的結(jié)果是將TCRA中未選擇的基因片段切除變成TRECs-TCRA，因此在T細(xì)胞內(nèi)發(fā)生缺失事件。
用來推斷癌癥體細(xì)胞拷貝數(shù)變化(SCNA)的工具依賴于讀取深度比(RDR)，反映腫瘤樣本與其匹配對(duì)照之間讀取比率的對(duì)數(shù)。在TCRA中檢測(cè)到的大多數(shù)SCNA反映的是相對(duì)T細(xì)胞含量的信號(hào)，為利用這一信號(hào)來量化T細(xì)胞含量，研究者開發(fā)出T細(xì)胞ExTRECT，它使用TCRA中的改良RDR直接量化WES樣本中的T細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1a)，即TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)。與來自RNA測(cè)序(RNA-seq)數(shù)據(jù)的方法不同，TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)是對(duì)樣本中T細(xì)胞比例的直接量化。TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)不依賴于樣本是否新鮮，冷凍或福爾馬林石蠟包埋(FFPE)。因此,T細(xì)胞ExTRECT可以適用于腫瘤或血液樣本。
2. TCRA T細(xì)胞組分的驗(yàn)證
為評(píng)價(jià)T細(xì)胞ExTRECT的準(zhǔn)確性，研究者采用五種正交方法。
首先,該研究能夠評(píng)估T細(xì)胞是否存在于某個(gè)樣本中,研究者使用自T細(xì)胞淋巴瘤和來自于HCT11的結(jié)直腸癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)。在所有的HCT116細(xì)胞系中，T細(xì)胞組計(jì)算分?jǐn)?shù)為0。相反，來自T細(xì)胞淋巴瘤的三個(gè)細(xì)胞系得分接近1。
其次，研究者使用一種基于DNA的替代方法(CDR3 V(D) J評(píng)分)來推斷免疫含量。研究者觀察到TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)與CDR3 V(D) J評(píng)分之間存在顯著正相關(guān)。然而，CDR3 V(D)J評(píng)分受測(cè)序深度的限制;與CDR3區(qū)域?qū)R的讀取數(shù)量通常非常低。
第三，研究者利用一系列的T細(xì)胞片段模擬下一代測(cè)序數(shù)據(jù)，觀察到模擬的和計(jì)算的T細(xì)胞分?jǐn)?shù)之間高度相關(guān)?；谀M，研究者發(fā)現(xiàn)TCRAT細(xì)胞分?jǐn)?shù)估值在覆蓋范圍上保持一致。當(dāng)選擇5個(gè)CDR3覆蓋率最高的樣本并將樣本降到50個(gè)時(shí)，CDR3方法的結(jié)果發(fā)生嚴(yán)重傾斜。
第四，為進(jìn)一步確認(rèn)TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)用于量化T細(xì)胞的準(zhǔn)確性，研究者評(píng)估其與蘇木精和伊紅染色組織來源樣本中的TIL評(píng)分的相關(guān)性。選擇具有RNA-seq數(shù)據(jù)和組織病理學(xué)來源的TIL評(píng)分的腫瘤樣本數(shù)據(jù)，研究者評(píng)估TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)、CDR3 V(D)J評(píng)分和基于RNA-seq的CD8+細(xì)胞免疫比例(TIMER，CIBERSORT等)與組織病理學(xué)得出的TIL評(píng)分進(jìn)行比較(圖1b)。Danaher CD8+評(píng)分相關(guān)性最強(qiáng)，其次便是TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)。
最后，研究者將WES的TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)與RNA-seq方法直接進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與多個(gè)免疫評(píng)分間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，其中與T細(xì)胞相關(guān)分?jǐn)?shù)相關(guān)性最強(qiáng)(圖1c)。
圖1. T細(xì)胞ExTRECT方法及其驗(yàn)證
3. 血液中T細(xì)胞含量的影響因素
接著，研究者在匹配的對(duì)照血液WES樣本中探索T細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的關(guān)鍵影響因素。
在TRACERx10013隊(duì)列中，女性血液TCRAT細(xì)胞比例顯著高于男性(圖2a)。與肺腺癌(LUAD)患者相比，肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)患者血液T細(xì)胞分?jǐn)?shù)有升高的趨勢(shì)。研究者還觀察到血液中TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)和匹配的腫瘤TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖2 a)。這些數(shù)據(jù)表明腫瘤免疫浸潤(rùn)可能影響循環(huán)血液中的T細(xì)胞水平，反之亦然。研究者在TCGA 中的LUAD和LUSC的數(shù)據(jù)中可觀察到一致結(jié)果。
為進(jìn)一步研究血液T細(xì)胞分?jǐn)?shù)的決定因素，研究者從血液和正常的食管上皮(PNE)組織中提取WES數(shù)據(jù)。雖然血液樣本表現(xiàn)出廣泛的TCRA T細(xì)胞比例水平,大多數(shù)PNE組織沒有檢測(cè)到T細(xì)胞浸潤(rùn)。通過T細(xì)胞浸潤(rùn)來分割PNE樣本，發(fā)現(xiàn)其與血液TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)顯著相關(guān)(圖2 b)。因此，與腫瘤樣本相似，正常組織中高水平的T細(xì)胞浸潤(rùn)可能會(huì)影響或受血液中觀察到的TCRA T細(xì)胞碎片的影響。在預(yù)測(cè)血液中T細(xì)胞比例的線性模型中，只有正常組織中的浸潤(rùn)水平是顯著的;沒有基因組因素，如正常的組織突變負(fù)擔(dān)或驅(qū)動(dòng)突變狀態(tài)被用于預(yù)測(cè)PNE組織中的T細(xì)胞浸潤(rùn)。
為探索病毒或細(xì)菌感染對(duì)血液中T細(xì)胞水平的影響，研究者對(duì)TCGA中LUAD和LUSC的腫瘤和血液的微生物豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化估計(jì)。微生物讀數(shù)升高的血液樣本具有明顯較高的TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)(圖2c)。
在腫瘤樣本中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的關(guān)聯(lián)。沒有特定的病毒或細(xì)菌與血液TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)相關(guān)。
4. 腫瘤T細(xì)胞含量的影響因素
接著，研究者對(duì)腫瘤組織中T細(xì)胞浸潤(rùn)的影響因素進(jìn)行探索。研究者基于最近發(fā)表的泛癌數(shù)據(jù)對(duì)免疫浸潤(rùn)異質(zhì)性的程度和可能的基因組基礎(chǔ)進(jìn)行探究，評(píng)估了來自12種癌癥類型178個(gè)腫瘤的731個(gè)樣本的T細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
研究者將每個(gè)多樣本腫瘤分為均勻熱(所有樣本TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)>0.11)，均勻冷(所有樣本TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)>0.11)或異質(zhì)性。不同類型腫瘤所占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2d)，其中雌激素受體陽(yáng)性(ER+)乳腺癌(BRCA)腫瘤異質(zhì)性最大(83%)，而LUSC腫瘤異質(zhì)性最小(22%)。不同類型癌癥在免疫浸潤(rùn)異質(zhì)性方面存在明顯差異，比如64%的BLCA腫瘤均為免疫熱，0%均為免疫冷，而在LUAD中，37%的腫瘤均為免疫冷，25%均為免疫熱。
接著，研究者對(duì)SCNA和免疫多樣性之間的關(guān)系進(jìn)行探索。研究者將分析限制在至少有三個(gè)樣本和T細(xì)胞浸潤(rùn)的異質(zhì)混合物的腫瘤患者中。任何兩個(gè)樣本之間的成對(duì)SCNA異質(zhì)性為任一樣本中具有獨(dú)特SCNA的基因組所占比例的總和。與TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)異質(zhì)性較低的配對(duì)樣本對(duì)相比，TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)差異較大的成對(duì)腫瘤樣本在SCNA異質(zhì)性上有較大的差異(圖2e)。
為探究與免疫衰竭或激活相關(guān)的特定亞克隆SCNA，研究者在泛癌多樣本隊(duì)列中識(shí)別出30多個(gè)腫瘤亞克隆缺失或獲得相關(guān)的細(xì)胞帶，并研究特定的SCNA是否與TCRA T細(xì)胞片段的變化相關(guān)。發(fā)現(xiàn)12q 24.31 32亞克隆缺失與TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)下降顯著相關(guān)(圖2 f)。
對(duì)TRACERx100隊(duì)列的RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，在有和沒有亞克隆12q24.31 32缺失的樣本中，SPPL3的表達(dá)差異最顯著。已發(fā)現(xiàn)SPPL3的缺失可增強(qiáng)B3GNT5酶活性，上調(diào)細(xì)胞表面鞘糖脂，進(jìn)而阻礙I類HLA功能，降低CD8+ T細(xì)胞活化等。因此，以上數(shù)據(jù)表明，包括SPPL3在內(nèi)的12q24.31亞克隆缺失可能是潛在的一種免疫逃避機(jī)制。
圖2. T細(xì)胞分?jǐn)?shù)的影響因素
5.T細(xì)胞分?jǐn)?shù)在LUAD中的預(yù)后作用
為探索T細(xì)胞ExTRECT的臨床應(yīng)用，研究者在TRACERx100的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)數(shù)據(jù)中驗(yàn)證TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)的預(yù)后作用。根據(jù)TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)在隊(duì)列中的平均值，研究者將腫瘤樣本分為冷熱兩種類型。在LUAD中，研究者觀察到，免疫冷腫瘤樣本數(shù)量升高的患者預(yù)后明顯較差(圖3)。在LUSC患者中，不同T細(xì)胞分?jǐn)?shù)患者之間的生存率沒有顯著差異。
圖3. TCRA T細(xì)胞組分對(duì)LUAD的預(yù)后價(jià)值
6. T細(xì)胞組分對(duì)CPIs的響應(yīng)
為進(jìn)一步探索T細(xì)胞ExTRECT的臨床應(yīng)用，研究者對(duì)T細(xì)胞組分與CPIs的臨床反應(yīng)之間的關(guān)系進(jìn)行探究。CPI1000+隊(duì)列包括1070例接受抗CTLA-4、抗PD-L1或抗PD-1治療的8種主要類型腫瘤患者。根據(jù)RECIST的影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將患者定義為響應(yīng)者或無響應(yīng)者。
研究者察到應(yīng)答者中腫瘤TCRA T細(xì)胞的分?jǐn)?shù)顯著更高(圖4a)且免疫冷性腫瘤在無應(yīng)答者中顯著富集(圖4b)。另外，TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)和臨床反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)與克隆TMB無關(guān)(圖4b)。為評(píng)估T細(xì)胞ExTRECT的有效性，研究者選擇同時(shí)包含RNA-seq和TCRA T細(xì)胞組分?jǐn)?shù)據(jù)，且包括至少10個(gè)樣本的癌癥類型進(jìn)行單變量meta分析(圖4c)。研究結(jié)果表明，TCRA T細(xì)胞組分、克隆TMB和CD8A表達(dá)均與CPIs反應(yīng)顯著相關(guān)。
為評(píng)估腫瘤TCRA T細(xì)胞片段是否能比CD8A表達(dá)更大程度地提高對(duì)CPIs應(yīng)答的預(yù)測(cè)能力，研究者評(píng)估了不同的線性模型。單克隆TMB + TCRA模型明顯優(yōu)于單克隆TMB模型。當(dāng)檢驗(yàn)所有模型變量的顯著性時(shí)，TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)比CD8A更顯著，當(dāng)組合成多變量模型時(shí)，TCRA T細(xì)胞組分仍然顯著，但CD8A表達(dá)不顯著。最后，研究者評(píng)估TCRA T細(xì)胞組分在接受CPI 治療的NSCLC隊(duì)列中的預(yù)測(cè)潛力。在單變量分析中(圖4d)， TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)和血液TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)與CPI反應(yīng)顯著相關(guān)。
這些結(jié)果表明，TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)可以作為RNA-seq測(cè)量CD8+浸潤(rùn)的替代品，TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)增加TMB的預(yù)后價(jià)值。
圖4. TCRA T細(xì)胞分?jǐn)?shù)可預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)
今天的內(nèi)容就是這些，最后讓我來總結(jié)一下吧。研究者基于對(duì)TRECs的缺失打分，構(gòu)建T細(xì)胞組分分?jǐn)?shù)；T細(xì)胞組分分?jǐn)?shù)與LUAD患者預(yù)后和患者對(duì)檢查點(diǎn)抑制劑（CPIs）的響應(yīng)高度相關(guān)。本研究的核心原理是當(dāng)T細(xì)胞成熟時(shí)，編碼T細(xì)胞受體的基因在可變區(qū)會(huì)發(fā)生重排，切掉部分序列；通過該區(qū)域序列丟失情況，對(duì)樣本中T細(xì)胞的豐度進(jìn)行量化。該方法相對(duì)便捷，且成本較低，具有重要的腫瘤研究以及應(yīng)用價(jià)值。
看了nature上的工作，小編不禁再次感嘆，自己啥時(shí)候才能想出這么精彩的思路，做出這么有創(chuàng)新性的假設(shè)呢。。?？磥硪胛恼掳l(fā)的多，平時(shí)積累少不了啊，大家彼此共勉吧。
