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小伙伴們大家好哇！今天小編給大家介紹的是今年7月發(fā)表在Cancer Discovery(IF=38.272)的一篇單細(xì)胞文章。作者通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和T細(xì)胞受體(TCR)測(cè)序揭示了胰腺導(dǎo)管癌患者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）的發(fā)育軌跡，生信分析一看就會(huì)，重點(diǎn)在于作者的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及豐富的生物學(xué)知識(shí)！快來(lái)和小編一起看看吧！
一.研究背景
胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)占所有確診胰腺癌的85%，5年生存率僅為9%，化療和手術(shù)仍然是主要的治療選擇。免疫治療是一種新的治療策略，在多種癌癥中實(shí)現(xiàn)了良好的臨床治療效果。由于癌癥患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)各不相同，了解與臨床反應(yīng)相關(guān)的腫瘤微環(huán)境(TME)的潛在免疫狀況是很重要的。盡管存在反應(yīng)性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL），但迄今為止PDAC對(duì)免疫療法缺乏反應(yīng)，并且迫切需要改進(jìn)治療方案。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)已成為一種強(qiáng)大的工具，通過(guò)在同一細(xì)胞中結(jié)合轉(zhuǎn)錄組譜和T細(xì)胞受體(TCR)庫(kù)，來(lái)研究復(fù)雜細(xì)胞群（如TIL）的異質(zhì)性。作者之前的工作研究已表明，腫瘤反應(yīng)性PDAC TIL體外擴(kuò)增用于過(guò)繼細(xì)胞治療(ACT)的可行性。因此，作者在本篇文章通過(guò)使用scRNA-seq和TCR測(cè)序相結(jié)合的方法對(duì)PDAC患者新切除的腫瘤和癌旁的組織進(jìn)行分析，從而描述PDAC TIL的特征，以期了解TIL在PDAC的細(xì)胞免疫治療中的應(yīng)用。
二.主要結(jié)果
1.T細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生成及分析
為了描述PDAC中的TIL亞狀態(tài)，作者對(duì)7個(gè)PDAC癌癥樣本和一個(gè)癌旁的胰腺樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，重點(diǎn)關(guān)注了CD3+TIL（圖1A）。除此之外，作者還整合了另外的兩套PDAC單細(xì)胞數(shù)據(jù)集（MDA2數(shù)據(jù)集：26例PDAC，10例癌旁；PUMCH數(shù)據(jù)集：24例PDAC，11例正常）。整合后，共39694個(gè)T細(xì)胞，來(lái)自57個(gè)PDAC樣本和22個(gè)癌旁/正常樣本。經(jīng)過(guò)聚類分群，共鑒定出5個(gè)CD4+TIL，7個(gè)CD8+TIL和一個(gè)周期性（cycling）T細(xì)胞亞群（圖1B）。
為了了解每個(gè)T細(xì)胞簇的生物學(xué)功能，作者研究了每個(gè)簇的高表達(dá)基因和特定的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。如圖1C結(jié)果顯示，不同T細(xì)胞簇具有顯著不同的細(xì)胞編程狀態(tài)差異：由于FOXP3、IL2RA(CD25)、CTLA4和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子IKZF2和IKZF4的表達(dá)，CD4-FOXP3簇被歸類為Treg；CD8+TIL群體中，通過(guò)TRM轉(zhuǎn)錄因子ZNF683的表達(dá)、TRM相關(guān)基因XCL1和GNLY的表達(dá)以及KLF2的低表達(dá)，CD8-ZNF683集群似乎是一個(gè)TRM樣群體；此外，高表達(dá)效應(yīng)細(xì)胞標(biāo)記物GZMB和PRF1和轉(zhuǎn)錄因子TBX21，被鑒定為細(xì)胞毒性CD8+細(xì)胞狀態(tài)；其中一組CD4-CXCL13和CD8-CXCL13顯示轉(zhuǎn)錄因子RBPJ和趨化因子CXCL13的表達(dá)，被認(rèn)為是功能失調(diào)T細(xì)胞表型；另一組CD4-CCR7和CD8-CCR7/IL7R，共同表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子LEF1和TCF7，被定義為中心記憶T細(xì)胞表型（Tcm）。
在整個(gè)數(shù)據(jù)隊(duì)列中，不同T細(xì)胞的頻率也顯著不同（圖1D）。此外，為了確定細(xì)胞狀態(tài)是否為腫瘤組織特異的，作者在具有匹配腫瘤和癌旁組織樣本的10名患者子集中比較了細(xì)胞狀態(tài)組成，結(jié)果表明：CD4-FOXP3和CD4-CXCR4細(xì)胞狀態(tài)在腫瘤組織中比癌旁組織中富集，而CD8-CXCR6/IL7R和CD8-GZMB/PRF1細(xì)胞狀態(tài)在癌旁組織比腫瘤組織中富集（圖1E）。
2. 通過(guò)軌跡圖揭示TIL轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)的轉(zhuǎn)變
由于T細(xì)胞具有極強(qiáng)的在不同功能和分化狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的能力，作者在此應(yīng)用偽時(shí)序推斷來(lái)理解已識(shí)別的細(xì)胞狀態(tài)之間的關(guān)系。因?yàn)镃D4+和 CD8+T細(xì)胞在胸腺內(nèi)選擇之外沒(méi)有發(fā)育相關(guān)性，所以作者分別對(duì)這些主要亞群進(jìn)行軌跡分析（圖2A、B）。對(duì)于CD8+TIL，推斷CD8-CCR7/IL7R TCM狀態(tài)和CD8-CXCR6/IL7R狀態(tài)在軌跡上相關(guān)；該軌跡也表明，CD8-GZMK可能是介于CD8-GZMB/PRF1細(xì)胞毒性細(xì)胞狀態(tài)和CD8-CXCL13潛在功能失調(diào)狀態(tài)之間的中間細(xì)胞狀態(tài)；此外，CD8-MX1細(xì)胞狀態(tài)與其他細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)系似乎不明確，因?yàn)樗鼈儧](méi)有發(fā)生在軌跡的一個(gè)分支上，這表明它們可能是一個(gè)單獨(dú)的狀態(tài)（圖2A）。作者還發(fā)現(xiàn)，除CD8-CXCR6/IL7R外，來(lái)自腫瘤和癌旁樣本的CD8+ TIL的貢獻(xiàn)是重疊的（圖2C）。從偽時(shí)間分析得出的相似性和近端狀態(tài)轉(zhuǎn)變可能表明，腫瘤外發(fā)現(xiàn)的TIL群體(CD8-CXCR6/IL7R)可能有轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤內(nèi)的狀態(tài)(CD8-ZNF683)。
接下來(lái)作者對(duì)CD4+TIL也進(jìn)行了相同的軌跡分析（圖2B）。結(jié)果顯示CD4-CXCR4細(xì)胞狀態(tài)與TCM簇相鄰，與CD8+TIL相比，由于CD4-TIL每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)具有更高的細(xì)胞密度，所以CD4+TIL的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變具有更高的可信度。與CD8-MX1類群相似，CD4-MX1簇與其他簇之間的關(guān)系尚不清楚，這可能是由于其樣本量較小。與CD8+ TIL不同，CD4+ TIL在腫瘤與癌旁之間具有同質(zhì)性(圖2D)。
為了確定T細(xì)胞狀態(tài)在同一PDAC樣本中共發(fā)生的程度，作者以逐個(gè)患者的方式對(duì)所有腫瘤樣本的細(xì)胞狀態(tài)頻率進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明：如果患者的A類細(xì)胞比例較高，那么他們的B類細(xì)胞比例也會(huì)較高，高度相關(guān)的CD8-MX1和CD4-MX1細(xì)胞狀態(tài)的頻率之間存在顯著的相關(guān)性（圖2E）。雖然CD4和CD8的這種細(xì)胞狀態(tài)與其他細(xì)胞狀態(tài)表達(dá)的許多基因相同，但只有CD8-MX1與CD4-FOXP3顯著正相關(guān)，證實(shí)了這些MX1狀態(tài)是獨(dú)立的，但同時(shí)也證實(shí)了富含干擾素的TME可能是它們顯著相關(guān)的原因，干擾素會(huì)影響這些細(xì)胞狀態(tài)。CD8-CXCL13和CD4-CXCL13細(xì)胞狀態(tài)之間存在顯著相關(guān)，再加上CD8-CXCL13細(xì)胞狀態(tài)與周期性T細(xì)胞群體之間存在顯著相關(guān)，提示CXCL13細(xì)胞狀態(tài)可能是TIL的增殖群體，盡管可能存在功能障礙。幾種T細(xì)胞狀態(tài)也呈現(xiàn)出了反比關(guān)系：例如CD8/CD4 CXCL13群體與CD4+ CXCR4效應(yīng)群體呈顯著負(fù)相關(guān)，提示T細(xì)胞功能異常的TME在某些效應(yīng)群體中含量較低。
3. TCR克隆型分布顯示擴(kuò)增的TIL克隆可以占據(jù)多種細(xì)胞狀態(tài)
為了進(jìn)一步了解T細(xì)胞狀態(tài)的潛在功能以及它們之間的關(guān)系，作者對(duì)7個(gè)樣本（MDA1隊(duì)列）的同一細(xì)胞子集進(jìn)行了單細(xì)胞TCR測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析。通過(guò)量化MDA1數(shù)據(jù)集與更大數(shù)據(jù)集之間的基因重疊，進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞狀態(tài)間的相似性（圖3A）。較小的MDA1隊(duì)列的UMAP圖提示了聚類的穩(wěn)健性，在CD8+和CD4+TIL的UMAP圖中，原始細(xì)胞狀態(tài)標(biāo)簽都保留了共定位（圖3B、C）。為了評(píng)估MDA1樣本集中采樣偏倚的可能性，作者分析了每個(gè)樣本中不同細(xì)胞狀態(tài)的比例（圖3D、E）。除了CD8-CXCL13細(xì)胞狀態(tài)主要來(lái)源于一個(gè)樣本外，其與細(xì)胞狀態(tài)均不受患者所主導(dǎo)。
因?yàn)樵诙鄠€(gè)細(xì)胞狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的克隆型(這里稱為細(xì)胞狀態(tài)共享)可能表明這些狀態(tài)之間的過(guò)渡，于是作者分析來(lái)自同一個(gè)單細(xì)胞的TCR序列和轉(zhuǎn)錄組信息，以確定細(xì)胞狀態(tài)之間的關(guān)系。對(duì)CD8+TIL和CD4+TIL的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)及其克隆頻率的可視化顯示，大多數(shù)克隆在低頻率下檢測(cè)到，表明在腫瘤部位的增殖有限（圖4A、B）。Circos圖的每條線都代表一個(gè)T細(xì)胞克隆，其中Circos圖外圈灰色線的高度與攜帶該TCR的細(xì)胞數(shù)量成比例。圖4A中的CD8轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)顯示，作者發(fā)現(xiàn)在CD8-GZMK細(xì)胞狀態(tài)(藍(lán)綠色)中，擴(kuò)展的TIL克隆型(即在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)多個(gè)拷貝)具有高度的細(xì)胞狀態(tài)共享（圖4C）。對(duì)于CD8-GZMK細(xì)胞狀態(tài)，18/40個(gè)TIL克隆型也被分配到至少一種其他細(xì)胞狀態(tài)，例如CD8-GZMK和CD8-ZNF683共享的6個(gè)克隆型（圖4D）。
在CD4+ TIL中，作者只發(fā)現(xiàn)了非常有限的克隆性簇共享，這表明腫瘤增殖能力較弱（圖4B、E）。這對(duì)于CD4-FOXP3細(xì)胞狀態(tài)(紅色)尤為顯著，在偽時(shí)序圖(圖2B)中可以看到，它與軌跡的其余部分的連接非常弱。這種細(xì)胞狀態(tài)和其他CD4狀態(tài)之間缺乏TCR共享，進(jìn)一步支持了這些細(xì)胞是先天的而不是誘導(dǎo)的Tregs的觀點(diǎn)。
4. 克隆擴(kuò)增發(fā)生在CD8+ TIL細(xì)胞而非CD4細(xì)胞
為了量化每個(gè)簇內(nèi)克隆擴(kuò)增的程度，作者通過(guò)計(jì)算患者CD4+和CD8+TIL的Gini指數(shù)來(lái)測(cè)量克隆頻率的均勻性。作者發(fā)現(xiàn)在基尼系數(shù)中值接近1的情況下，CD8+ TIL簇在患者中顯示出比CD4+ TIL更高程度的寡克隆性，然而，作者利用Shannon多樣性指數(shù)(另一種同時(shí)考慮克隆均勻度和克隆型豐度的多樣性指標(biāo))時(shí)，作者觀察到CD8+ TIL的多樣性總體上低于CD4+ TIL（圖5A）。
當(dāng)通過(guò)基于細(xì)胞狀態(tài)分析時(shí)，作者觀察到一個(gè)相似的模式，所有CD4+ TIL狀態(tài)表現(xiàn)出比大多數(shù)CD8+ TIL狀態(tài)更低的克隆性（圖5B）。CD8+TIL的高克隆性主要來(lái)自于CD8- GZMK、CD8- GZMB/PRF1和CD8- CXCL13細(xì)胞狀態(tài)；CD4+ TIL不一定是這樣，因?yàn)镃D4細(xì)胞狀態(tài)(CD4-FOXP3)的寡克隆擴(kuò)增幾乎是最高的。CD8- GZMK、CD8-ZNF683、CD8-GZMB/PRF1和CD8-CXCL13在TME中有最大比例的克隆擴(kuò)增細(xì)胞，表明其克隆擴(kuò)增很穩(wěn)定。這與CD8-CXCR6/IL7R細(xì)胞狀態(tài)相反，其中僅有四分之三的克隆被檢測(cè)到一次（圖5C）。綜上所述，這些指標(biāo)表明，盡管CD8+TIL群體與CD4+TIL具有相似的克隆型豐富度水平，但CD8+效應(yīng)群體的克隆性更高，這表明有選擇性的TIL克隆參與了對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答。
5. TIL轉(zhuǎn)錄組分析和TCR測(cè)序揭示了它們?cè)隗w外繁殖后的命運(yùn)
對(duì)于MDA1隊(duì)列，每個(gè)組織的一塊被用于離體TIL培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的TIL用于轉(zhuǎn)錄組和TCR單細(xì)胞測(cè)序（圖6A）。圖6B展示了分群情況，圖6C展示各個(gè)細(xì)胞分群的基因表達(dá)情況。
以細(xì)胞為基礎(chǔ)的癌癥免疫治療領(lǐng)域的一個(gè)主要目標(biāo)是識(shí)別和選擇最佳的T細(xì)胞亞型，以提供最有效的過(guò)繼細(xì)胞治療。作者發(fā)現(xiàn)，無(wú)論其在組織中的初始轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞狀態(tài)如何，TIL克隆型在多種生長(zhǎng)細(xì)胞狀態(tài)下均被鑒定出來(lái)，其中大多數(shù)為培養(yǎng)產(chǎn)物中的G1-CD8-CD27亞型（圖6D）。盡管在任何最終生長(zhǎng)的細(xì)胞狀態(tài)和特定的初始PDAC TIL群體之間缺乏聯(lián)系，但有跡象表明，組織中的某些TIL群體優(yōu)先生長(zhǎng)（圖6E、F）。來(lái)自CD8-GZMK、CD8-ZNF683和CD8-GZMB/PRF1細(xì)胞簇的T細(xì)胞克隆在體外優(yōu)先擴(kuò)增，而來(lái)自CD8-CXCL13細(xì)胞簇的T細(xì)胞克隆相對(duì)于其在組織中的初始頻率下降（圖6E）。CD4+ TIL表現(xiàn)出類似的模式，主要是CD4+效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)增，而Treg細(xì)胞不擴(kuò)增（圖6F）。作者提出了一個(gè)PDAC TIL的組織關(guān)系和分化軌跡的模型，以及它們?cè)隗w外培養(yǎng)的每個(gè)成分群體中無(wú)限制擴(kuò)展的模型（圖7）。
到這里這篇文章就介紹完啦，總結(jié)一下：作者通過(guò)對(duì)PDAC患者的癌癥樣本和癌旁進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序和TCR測(cè)序，并將腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）分為CD8+和CD4+TIL分別推斷了其分化發(fā)育軌跡；通過(guò)TCR測(cè)序分別識(shí)別了在兩種TIL中的共享及獨(dú)有的克隆擴(kuò)增。乍一看分析極其簡(jiǎn)單，但是巧妙在作者在分析scRNA-seq數(shù)據(jù)時(shí)結(jié)合了公共數(shù)據(jù)，擴(kuò)大了樣本量，使文章數(shù)據(jù)更加飽滿。更加值得一提的是，作者對(duì)自己的樣本不僅僅進(jìn)行了測(cè)序，還預(yù)留了一部分組織進(jìn)行了體外培養(yǎng)及測(cè)序分析，再體外培養(yǎng)印證作者的結(jié)果以及分析與患者體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)的不同，緊扣過(guò)繼細(xì)胞治療的主題。全文生信分析并不難，大量的生物學(xué)知識(shí)使整個(gè)文章豐富飽滿，感興趣的小伙伴可以拜讀一下原文哦！
