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膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，患者的中位生存期僅在12到15個(gè)月之間,因此，需要發(fā)現(xiàn)更有效的治療方法來改善病人的預(yù)后。小編今天和大家分享一篇今年六月剛剛發(fā)表在Journal of Translational Medicine（IF:5.531）雜志上的關(guān)于膠質(zhì)瘤預(yù)后的純生信分析文章。文章聚焦小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，收集多個(gè)平臺的數(shù)據(jù)，對小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基因及功能進(jìn)行了分析，主要使用的方法包括差異表達(dá)分析，功能富集分析，隨機(jī)游走，及生存分析在內(nèi)的生信常用方法，文章簡單易懂，邏輯清晰，感興趣的小伙伴不要錯(cuò)過呀。
Comprehensive analysis of microglia gene and subpathway signatures for glioma prognosis and drug screening: linking microglia to glioma
膠質(zhì)瘤預(yù)后和藥物篩選相關(guān)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基因和子通路特征綜合分析:小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤的關(guān)聯(lián)
一．摘要
膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的惡性腫瘤。以往研究表明，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)中的先天免疫細(xì)胞，參與了膠質(zhì)瘤的病理過程。研究整合多個(gè)平臺的公共數(shù)據(jù)資源，分析了膠質(zhì)瘤內(nèi)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性生物學(xué)特征，揭示了膠質(zhì)瘤小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤巨噬細(xì)胞比較(MicT/MacT)和膠質(zhì)瘤小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與正常小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞比較(MicT/ MicN)兩種情況下的生物學(xué)特征。識別出9個(gè)核心MicT/MicN基因，它們與膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)。此外，研究也基于隨機(jī)游走策略識別出小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路，并開發(fā)了用于膠質(zhì)瘤預(yù)后分析的SubP28特征。文章還分析了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 （GBM）和低階膠質(zhì)瘤（LGG）中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化與SuP28特征之間的關(guān)系。最后，研究建立了一個(gè)全面的藥物-子通路網(wǎng)絡(luò)，用于篩選候選的治療分子?？傊恼峦ㄟ^大規(guī)模數(shù)據(jù)集，分析小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因和功能，建立了一個(gè)框架對小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤之間的內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行了解析。
二．背景
研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤微環(huán)境由多種非腫瘤細(xì)胞組成，這些細(xì)胞在腫瘤生長、進(jìn)展、免疫反應(yīng)逃避等方面發(fā)揮著重要作用。其中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞，分布于整個(gè)大腦，其功能包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，支持神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)，維持血腦屏障(BBB)的完整性等。研究發(fā)現(xiàn)在健康的大腦中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的周轉(zhuǎn)很少，然而，血液中的巨噬細(xì)胞卻表現(xiàn)出很高的周轉(zhuǎn)率。雖然這兩個(gè)免疫細(xì)胞亞群是腦免疫系統(tǒng)的主要組成部分，但在腦病理中觀察到小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和外周巨噬細(xì)胞具有不同的功能。此外，GBM腫瘤中報(bào)道了這兩種巨噬細(xì)胞群的相反作用。不過小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的生物學(xué)差異，以及細(xì)胞特異性參與膠質(zhì)瘤事件還有待于進(jìn)一步刻畫。
三．?dāng)?shù)據(jù)及方法
1. 基因表達(dá)數(shù)據(jù)集：研究從GEO數(shù)據(jù)庫中收集膠質(zhì)瘤患者腦組織中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)。所用數(shù)據(jù)集為GSE65868、GSE86573和GSE80338，其中疾病狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量均來自以往的研究。其中GSE86573數(shù)據(jù)集不考慮血液組織，將腦組織作為正常樣本，GSE80338數(shù)據(jù)將癲癇和死后標(biāo)本作為正常標(biāo)本。此外，作者為了研究小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基因及功能特征在膠質(zhì)瘤病理中的生物學(xué)作用，從GEO、TCGA、Chinese glioma Genome Atlas (CGGA)和Pan-Cancer Analysis of Whole Genom(PCAWG)數(shù)據(jù)庫中獲取了包含膠質(zhì)瘤臨床信息的大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。最終共納入26組數(shù)據(jù)集。這些數(shù)據(jù)集包含3種膠質(zhì)瘤事件，包括膠質(zhì)瘤和正常樣本、復(fù)發(fā)和原發(fā)樣本以及有預(yù)后信息的樣本。
2. 差異表達(dá)分析：研究利用兩種方法分別對RNA序列和芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析。對于RNA序列數(shù)據(jù)集(GSE86573和GSE80338)，利用R包 DEseq2根據(jù)原始計(jì)數(shù)矩陣識別差異表達(dá)基因。對于芯片數(shù)據(jù)集(GSE65868)，作者結(jié)合差異倍數(shù)和t檢驗(yàn)，基于FPKM表達(dá)矩陣識別差異表達(dá)基因。
3. 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因的功能探索：研究基于MicroT/MacroT數(shù)據(jù)集和MicroT/ MicroN數(shù)據(jù)集共享的一致差異表達(dá)基因，進(jìn)一步使用R包 clusterProfler進(jìn)行功能富集分析，考慮了GO生物過程(BP)。同時(shí)，從分子特征數(shù)據(jù)庫(MsigDB)中獲取腫瘤hallmarkers基因集進(jìn)行功能關(guān)聯(lián)分析。采用超幾何檢驗(yàn)評估一致基因與已知hallmarkers之間的相關(guān)性。
4. 新的識別小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路框架：為了從功能層面探索小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)作用，作者開發(fā)了一個(gè)新的框架來識別小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路。研究將MicT/ MacT組的2個(gè)數(shù)據(jù)集及MicT/MicN組的3個(gè)數(shù)據(jù)集共享的一致的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基因特征作為種子節(jié)點(diǎn)。將上調(diào)及下調(diào)基因作為種子注釋到網(wǎng)絡(luò)中。同時(shí)，對種子節(jié)點(diǎn)的全局影響進(jìn)行4次隨機(jī)游走算法評估。經(jīng)過隨機(jī)游走算法，每個(gè)候選基因分別從MicT/MacT和MicT/MicN組中得到4個(gè)分?jǐn)?shù)。然后，從R包subpathwayMiner中得到子通路列表。對于每個(gè)子通路，根據(jù)隨機(jī)游走分析的基因評分計(jì)算子通路評分。經(jīng)上述分析，p值<0.001的子通路被確定為小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路。如果任意兩個(gè)子通路共享超過7個(gè)基因成分，則根據(jù)這些子通路構(gòu)建子通路網(wǎng)絡(luò)。
5. 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞子通路與膠質(zhì)瘤生物學(xué)的關(guān)系：對于所有膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集，作者考慮了三種類型的比較，包括腫瘤與正常樣本的比較、復(fù)發(fā)與原發(fā)樣本的比較、高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)樣本的比較。利用R包limma進(jìn)行差異表達(dá)分析。接著進(jìn)行單因素cox分析，識別高?；虻臀；?。沒有顯著基因結(jié)果的數(shù)據(jù)集被刪除。然后，利用超幾何檢驗(yàn)方法評估子通路內(nèi)基因與各數(shù)據(jù)集高風(fēng)險(xiǎn)或低風(fēng)險(xiǎn)基因的重疊情況。
6. 確定子通路預(yù)后模型：文章利用芯片表達(dá)譜作為訓(xùn)練集，構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后模型。作者首先利用R包SVA中的Combat函數(shù)消除批處理效應(yīng)，形成一個(gè)合并訓(xùn)練集。在訓(xùn)練集的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步計(jì)算每個(gè)子通路的NES富集分?jǐn)?shù)。然后，通過最大似然估計(jì)和Lasso得到了廣義線性模型，接著確定最優(yōu)參數(shù)λ，并選擇具有非零系數(shù)的子通路特征。
7. 基于HGCC資源構(gòu)建藥物-子通路網(wǎng)絡(luò)：作者基于HGCC資源獲得了GBM細(xì)胞系的藥物IC50信息，以及基因表達(dá)、甲基化和CNV數(shù)據(jù)。首先，作者以IC50中值為閾值，定義了高IC50組和低IC50組細(xì)胞系。然后以這兩組為基礎(chǔ)，分別根據(jù)基因表達(dá)水平、甲基化情況和CNV數(shù)據(jù)識別藥物相關(guān)基因。 最后，利用超幾何檢驗(yàn)評估差異基因與28條小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞子通路之間的關(guān)聯(lián)。綜合考慮這三個(gè)層次的組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個(gè)完整的藥物子通路網(wǎng)絡(luò)。
四．研究的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集整合分析揭示小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性生物學(xué)作用
為了探索小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在膠質(zhì)瘤條件下的特定生物學(xué)作用，在文章的第一部分，作者納入了一系列已發(fā)表的RNA序列和芯片數(shù)據(jù)集，這些數(shù)據(jù)來自從膠質(zhì)瘤和正常樣本分離的腦小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞群體?？紤]到小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性生物學(xué)特性，作者進(jìn)行了兩種差異表達(dá)分析，分別為腫瘤小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與腫瘤巨噬細(xì)胞的比較(MicT/MacT，包括兩個(gè)數(shù)據(jù)集)和腫瘤小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與正常小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比較(MicT/MicN，包括四個(gè)數(shù)據(jù)集)。作者根據(jù)MicT/MacT和MicT/MicN的每個(gè)數(shù)據(jù)集識別差異表達(dá)基因（圖1A），接著對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析（圖1B）。接下來為了進(jìn)一步探索這些小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性特征基因之間的關(guān)系，作者構(gòu)建了一個(gè)基于MicT/MacT和MicT/MicN共享的一致差異表達(dá)基因的子網(wǎng)絡(luò)。并基于已有研究的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，得到了至少兩種資源共享的高質(zhì)量互作關(guān)系。然后，基于PPI關(guān)系構(gòu)建了一致特征基因之間的直接相互作用(圖1C)。作者將MicT/MacT或MicT/MicN內(nèi)部具有相同方向的交互定義為組內(nèi)交互，其他交互定義為組外交互。作者對得到的網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)許多MicT/MicN特征位于這個(gè)子網(wǎng)絡(luò)的中心，并與其他基因密切相互作用。而一些MicT/MacT特征則在群體交互之外。
2. 膠質(zhì)瘤生物學(xué)中的9 MicT/MicN核心基因特征
在文章的第二部分，作者將4個(gè)MicT/MicN數(shù)據(jù)集中共有的9個(gè)基因定義為MicT/MicN核心基因，并進(jìn)一步分析這些小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因在膠質(zhì)瘤形成、復(fù)發(fā)和預(yù)后等生物學(xué)問題中的參與情況。作者收集了34個(gè)來自GEO、TCGA、CGGA和PCAWG的公共數(shù)據(jù)集，分析發(fā)現(xiàn)如圖2A所示，這9個(gè)MicT/MicN核心基因與膠質(zhì)瘤生物學(xué)密切相關(guān)。一些基因在不同的膠質(zhì)瘤事件中表現(xiàn)出一致的表達(dá)模式。例如，OAS3和MMP19在膠質(zhì)瘤樣本中表達(dá)水平高于正常樣本，在復(fù)發(fā)樣本中表達(dá)水平高于原發(fā)樣本，在高危組中表達(dá)水平高于低危組（圖2B）。研究也觀察到這些基因中，有5個(gè)基因與腫瘤純度顯著相關(guān)(圖2C和D)，不過對于GBM和LGG，P2RY2在高純度和低純度組中均顯示出一致的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測性能。因此作者也用足夠的樣本數(shù)量測試了P2RY2特征與LGG型臨床反應(yīng)的關(guān)系(圖2E)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與預(yù)后表現(xiàn)一致，接著分析了其生物學(xué)作用，發(fā)現(xiàn)P2RY2的表達(dá)水平與GBM創(chuàng)面愈合功能有關(guān)，與LGG新抗原和非整倍體功能有關(guān)(圖2F)。
3. 識別小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路和串?dāng)_網(wǎng)絡(luò)
先前的一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)通路中的子通路區(qū)域與疾病的形成和進(jìn)展密切相關(guān)。因此在這一部分，作者進(jìn)一步開發(fā)了一種基于MicT/MacT和MicT/MicN條件識別小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路的新框架。作者首先應(yīng)用了基于網(wǎng)絡(luò)的隨機(jī)游走算法來優(yōu)化MicT/MacT和MicT/MicN組一致上調(diào)和下調(diào)特征的候選基因。其次，作者綜合考慮不同的失調(diào)影響，得到子通路列表并計(jì)算子通路評分。最后采用隨機(jī)策略評估所有子通路的顯著性。結(jié)果共識別出1/34個(gè)MicT/MacT上調(diào)/下調(diào)的子通路，18/46個(gè)MicT/MicN上調(diào)/下調(diào)的子通路。最后，作者基于四種類型的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路，利用基因重疊構(gòu)建了一個(gè)子通路串?dāng)_網(wǎng)絡(luò)。
4. 與膠質(zhì)瘤生物學(xué)相關(guān)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞子通路
基于上述圖2A中使用的膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集，在這一部分作者進(jìn)一步探索了小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路與膠質(zhì)瘤生物學(xué)事件之間的關(guān)聯(lián)。如圖3A所示，所有這些子通路都表現(xiàn)出兩種表達(dá)模式。在膠質(zhì)瘤的形成、復(fù)發(fā)和預(yù)后中，大多數(shù)I型子通路表現(xiàn)為風(fēng)險(xiǎn)表達(dá)模式，而II型子通路表現(xiàn)為保護(hù)表達(dá)模式。I型子通路主要來源于免疫系統(tǒng)和細(xì)胞群落類，II型子通路來源于細(xì)胞運(yùn)動性、發(fā)育和再生類。在膠質(zhì)瘤生物學(xué)上，這些子通路與腫瘤的形成密切相關(guān)，尤其是預(yù)后狀況。以通路:04810_15(來自Type II)為例，該子通路在腫瘤樣本中表現(xiàn)出較高的表達(dá)模式。接下來，作者用ssGSEA方法計(jì)算了該子通路的NES評分(圖3B，C)，發(fā)現(xiàn)與之前結(jié)果的表達(dá)模式相似，該子通路在腫瘤樣本中確實(shí)表現(xiàn)出更高的功能活性，在復(fù)發(fā)樣本中也表現(xiàn)出更高的功能活性。
5. 膠質(zhì)瘤預(yù)后的子通路風(fēng)險(xiǎn)特征
上面的研究結(jié)果顯示，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的子通路與膠質(zhì)瘤的預(yù)后密切相關(guān)，尤其是LGG類型。因此，在這一部分作者進(jìn)一步使用Lasso基于整合的1185例膠質(zhì)瘤樣本芯片數(shù)據(jù)集構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后模型。結(jié)果識別出28個(gè)預(yù)測性能最好的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路，并將其定義為SubP28特征通路。分析發(fā)現(xiàn)在CGGA、TCGA和PCAWG數(shù)據(jù)庫的7個(gè)獨(dú)立測試集中，SubP28得分高的樣本比得分低的樣本表現(xiàn)出一致的不良生存結(jié)果(圖4A)。在腫瘤純度方面，作者觀察到LGG樣本的SubP28評分與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)。此外，作者在IGAP數(shù)據(jù)中量化了SubP28特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)侵襲性膠質(zhì)瘤邊緣和浸潤性腫瘤區(qū)域的樣本中富集了SubP28特征的較高功能活性，而這些子通路特征在腫瘤中表現(xiàn)出較低的活性(見圖4B)。為了檢驗(yàn)SubP28特征的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性，作者進(jìn)一步從MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲取了幾個(gè)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)集，并使用超幾何檢驗(yàn)計(jì)算重疊的顯著性。如圖4C所示，SubP28特征與其他小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(MG)標(biāo)記密切相關(guān)。此外，不同亞型的膠質(zhì)瘤預(yù)后結(jié)果不同，GBM分子亞型之間的SubP28評分也存在差異(見圖4D)，間充質(zhì)和神經(jīng)類型的樣本的SubP28評分高于其他類型。相關(guān)分析顯示，SubP28評分與巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)功能正相關(guān)，與CD4 T細(xì)胞負(fù)相關(guān)(見圖4E)。
6. SubP28與GBM和LGG的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)
為了進(jìn)一步探討SubP28信號與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)之間的關(guān)系，在這一部分作者使用ssGSEA方法計(jì)算TCGA GBM和LGG樣本的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞評分。利用穩(wěn)態(tài)標(biāo)記物和M2標(biāo)記物進(jìn)行相關(guān)性分析。如圖5A所示，LGG樣本的SubP28評分與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)狀態(tài)呈正相關(guān)，GBM樣本則不。GBM標(biāo)本M1和M2小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)下，SubP28評分與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活性呈正相關(guān)。當(dāng)考慮到分子亞型和IDH1突變時(shí)，進(jìn)一步觀察到M1和M2特異性關(guān)聯(lián)(圖5B)。作者也發(fā)現(xiàn)在未發(fā)生IDH1突變的LGG樣本中，SubP28評分與M1標(biāo)記呈正相關(guān)。對于GBM分子亞型，其與M1和M2標(biāo)記呈神經(jīng)類型特異性正相關(guān)。此外，利用膠質(zhì)瘤的兩個(gè)單細(xì)胞RNAseq數(shù)據(jù)集在多個(gè)細(xì)胞中測試SubP28特征，發(fā)現(xiàn)SubP28特異性與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)。
7. 藥物-子通路網(wǎng)絡(luò)揭示了新的治療策略
在文章的最后一部分作者為了預(yù)測高SubP28或低SubP28患者的藥物敏感性，系統(tǒng)地評估了SubP28評分與抗腫瘤藥物反應(yīng)敏感性之間的關(guān)系。研究從三個(gè)資源獲得藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)，(1)GDSC數(shù)據(jù)庫，(2)HGCC隊(duì)列，(3)LENP的預(yù)測結(jié)果。利用半數(shù)最大抑制濃度(IC50)值，計(jì)算藥物或分子IC50與SubP28評分的相關(guān)性。結(jié)合相關(guān)結(jié)果和藥物治療信息，得到了兩個(gè)候選藥物集，(1)SubP28評分高的細(xì)胞系對藥物表現(xiàn)出較高的反應(yīng)敏感性，(2)SubP28評分低的藥物表現(xiàn)出較高的敏感性。在藥物組1中，治療BRCA的藥物拉帕替尼在SubP28評分高的組中被識別為敏感分子。為了探究抗腫瘤化合物和28條小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞子通路之間的詳細(xì)關(guān)聯(lián)，作者基于HGCC資源構(gòu)建了一個(gè)多組學(xué)集成網(wǎng)絡(luò)。如圖6所示，多個(gè)候選藥物從三個(gè)組學(xué)水平靶向了許多小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性子通路。這些子通路中的大多數(shù)都屬于SubP28模型中的風(fēng)險(xiǎn)子通路。來自同一通路的不同子通路顯示相反的預(yù)后模式，也共享一些藥物。
到這里文章的主要內(nèi)容就介紹完了，文章重點(diǎn)關(guān)注小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)合基因及通路兩個(gè)層面，從表達(dá)及功能角度對小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了刻畫。文章用到的方法都是常見的生信方法，小編認(rèn)為亮點(diǎn)在于數(shù)據(jù)量豐富，整合多個(gè)平臺的數(shù)據(jù)既可以讓自己的工作內(nèi)容充實(shí)，也可以增加說服力。因此，小伙伴們在進(jìn)行自己課題時(shí)也可以考慮這種方式。
