掃碼聯(lián)系客服
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的提出，為我們提供了一個(gè)更精細(xì)的，在單細(xì)胞細(xì)胞水平上的研究視野。但是值得注意的是傳統(tǒng)的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，如通過制備細(xì)胞懸液的方式來獲得單個(gè)細(xì)胞，這個(gè)過程會(huì)破壞掉組織原始的空間結(jié)構(gòu)，從而喪失了各種細(xì)胞在組織上的空間分布信息。而我們知道存在相互作用關(guān)系的細(xì)胞之間在空間上的分布具有聚集性，因此傳統(tǒng)的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)就丟失了各種細(xì)胞空間分布的重要信息。隨后，單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的提出在一定程度上為我們提供了各種細(xì)胞在原始組織上的空間分布信息，但是由于技術(shù)的限制，目前單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)每一個(gè)spot上都是幾個(gè)甚至幾十個(gè)細(xì)胞的混合體。因此，基于目前的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，我們?nèi)詿o法真正在空間組上做到單個(gè)細(xì)胞水平的測(cè)序。
今天小編就來介紹一種技術(shù)：PIC-seq（physically interacting cells），這種方法采用了溫和的組織解離手段，形成了能夠很好的保留組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞聚集體。隨后，通過對(duì)物理接觸的細(xì)胞聚集體的分析，實(shí)現(xiàn)高分辨率的細(xì)胞間相互作用研究?？傮w上說，這種方法結(jié)合了單細(xì)胞和PIC復(fù)合物的scRNA-seq數(shù)據(jù)，將每個(gè)測(cè)序的PIC復(fù)合物以計(jì)算的方式反卷積為兩個(gè)或更多的單細(xì)胞。此外，PIC-seq通過比較PIC及參與的單個(gè)細(xì)胞來表征細(xì)胞間串?dāng)_下游的基因調(diào)控。
通過PIC-seq技術(shù)，研究者首先可以通過熒光激活細(xì)胞分選，從而分離出PIC。接著通過大規(guī)模平行RNA單細(xì)胞測(cè)序（MARS-seq）獲取多個(gè)相互作用細(xì)胞的組合RNA譜的信息。然后，通過計(jì)算反卷積算法推定復(fù)合物的細(xì)胞組成，及PIC和單細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄狀態(tài)分布的比較模型，對(duì)PIC-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。下面小編就通過兩篇有關(guān)PIC-seq技術(shù)的高分研究來系統(tǒng)介紹一下，如何巧妙的利用PIC-seq來開展我們自己的研究工作。
1. PIC-seq揭示存在物理相互作用的細(xì)胞之間的互作
第一項(xiàng)研究也是PIC-seq技術(shù)最先提出時(shí)發(fā)表在Nature Biotechnology上的一篇文章，篇名為：Dissecting cellular crosstalk by sequencing physically interacting cells。作者首先使用PIC-seq分選系統(tǒng)對(duì)兩種不同培養(yǎng)混合物進(jìn)行了處理，但發(fā)現(xiàn)分選并不成功，雜散顆粒很少，且?guī)缀鯖]有PIC。于是乎還是之前一句老話，所謂技術(shù)不夠，算法來湊。為了實(shí)現(xiàn)混合粒子反卷積，作者開發(fā)了一種回歸策略，給每種混合物中相互作用的細(xì)胞類型賦予一個(gè)值（UMI, unique molecular identifier）。根據(jù)在每個(gè)譜系中觀察到的各細(xì)胞類型的特定信息，高精度地模擬推導(dǎo)估計(jì)混合因子。
該方法結(jié)合了單細(xì)胞和PIC復(fù)合物的scRNA-seq數(shù)據(jù)，將每個(gè)測(cè)序的PIC復(fù)合物以計(jì)算的方式反卷積為兩個(gè)或更多的單細(xì)胞。此外，PIC-seq通過比較PIC及參與的單個(gè)細(xì)胞來表征細(xì)胞間串?dāng)_下游的基因調(diào)控。作者還使用PIC-seq在體外和體內(nèi)研究了T細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的相互作用，以表征相互作用特異性及其激活的基因表達(dá)程序。。
圖1：
作者首先在體外模型中驗(yàn)證PIC-seq的可行性，將CD11c+ DCs（用LPS和抗原激活）和CD4+ T細(xì)胞（卵清蛋白特異性αβ-TCRs）進(jìn)行不同時(shí)間的單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)（3 h，20 h，44 h）后，分別用PIC-seq進(jìn)行測(cè)序。FACS分選共培養(yǎng)的T細(xì)胞-DC PICs，得到TCRβ和CD11c雙陽性的細(xì)胞占5.68 ± 0.53%。分析單一的T細(xì)胞或者DC細(xì)胞以及PICs的基因表達(dá)和細(xì)胞成分，結(jié)合單細(xì)胞模型數(shù)據(jù)和每個(gè)PICs的UMI分?jǐn)?shù)，可推斷出每個(gè)PIC的最大可能組合，表明PIC-seq可用于相互作用細(xì)胞的分析。
2. PIC-seq揭示T細(xì)胞與DC的相互作用決定T細(xì)胞的活化及分化
隨后，研究者在野生型小鼠耳廓皮內(nèi)注射熒光標(biāo)記的巴西日?qǐng)A線蟲（Nb）或磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。注射48 h后，獲得引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞-抗原遞呈細(xì)胞（APC）PICs。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，研究者發(fā)現(xiàn)TCR+ 和CD11c+ 細(xì)胞群占總?cè)旱?.31 ± 0.06%，并使用共聚焦顯微鏡來評(píng)估組織的離解和對(duì)PICs的分選效率。結(jié)果表明T細(xì)胞和APC存在高度異質(zhì)性，因此，研究者通過轉(zhuǎn)錄本信息將其劃分為多個(gè)亞群。通過分析結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)，在PICs中富集了Treg和CD8記憶T細(xì)胞。與PBS對(duì)照組相比，注射了Nb的PICs中單核細(xì)胞數(shù)量增加。與體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，PICs間的差異表達(dá)高度依賴于T細(xì)胞和APCs的類型。
圖3：
研究者接下來通過對(duì)T細(xì)胞和髓系細(xì)胞進(jìn)行PIC-seq發(fā)現(xiàn)，在引流淋巴結(jié)中無論是PBS對(duì)照組，還是注射Nb樣本，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和髓系細(xì)胞之間的相互作用頻率很高。為了驗(yàn)證Treg細(xì)胞與APCs相互作用的能力，研究者使用FACS和共聚焦顯微鏡來表征表達(dá)Foxp3熒光報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠PICs和單個(gè)細(xì)胞中的Treg頻率。結(jié)果表明，T細(xì)胞和DC 細(xì)胞的PICs中Treg比例（23.3%）高于單獨(dú)T細(xì)胞中的Treg比例（4.55%）。Nb樣本來源的T細(xì)胞-DC PICs特異性上調(diào)了趨化因子Ccl22和Ccl17，共刺激因子Cd40、Ebi3和Dll4基因，表明了注射Nb樣本來源的特異性細(xì)胞相互作用。因此，PIC-seq能夠表征細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，對(duì)于識(shí)別細(xì)胞-細(xì)胞相互作用信號(hào)分子的新靶點(diǎn)具有很大的潛力。
圖4：
總的來說，這項(xiàng)研究首次提出了一種基于細(xì)胞分選和測(cè)序的新方法——PIC-seq，它可以用于分析原本在物理上結(jié)合的多種細(xì)胞類型之間的相互作用，以確定相互作用的特異性和被這些相互作用激活的基因表達(dá)程序，有望應(yīng)用于傳染病、腫瘤免疫和免疫治療等領(lǐng)域的研究。當(dāng)然，PCI-seq還存在一些局限性，比如不同的解離方法對(duì)特定的相互作用對(duì)表現(xiàn)出偏好，所以不能捕獲在體內(nèi)發(fā)生的全部相互作用。此外，PIC-seq算法要求相互作用的細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上不能太相似，才能成功地反卷積。因此，它不能直觀地應(yīng)用于由相似或相同的細(xì)胞組成的雙重態(tài)的研究，有待未來進(jìn)一步優(yōu)化和解決。
3. PIC-seq用于揭示腫瘤微環(huán)境中復(fù)雜的細(xì)胞相互作用
腫瘤微環(huán)境不僅影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且和免疫治療應(yīng)答密切相關(guān)。限于腫瘤微環(huán)境高度的異質(zhì)性，和復(fù)雜的細(xì)胞作用關(guān)系，傳統(tǒng)的研究方法已無法準(zhǔn)確揭示腫瘤微環(huán)境各細(xì)胞之間的相互作用。因此基于單細(xì)胞測(cè)序的各種相關(guān)技術(shù)，為我們提供一個(gè)嶄新的視野深入解析腫瘤微環(huán)境中的免疫學(xué)機(jī)制。
接下來要介紹的一篇研究是利用PIC-seq研究腫瘤微環(huán)境中存在的細(xì)胞相互作用，于今年發(fā)表在Nature cancer 雜志上，篇名為：The interaction of CD4+ helper T cells with dendritic cells shapes the tumor microenvironment and immune checkpoint blockade response。在這些研究中，作者通過PIC-seq對(duì)人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)進(jìn)行分析，詳細(xì)描述了CD4+輔助T細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的相互作用，并且作者在體外和卵清蛋白特異性αβTCRCD4+T-t細(xì)胞模型中重建了它們的相互作用，發(fā)現(xiàn)了Tht程序由呈現(xiàn)腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞在腫瘤淋巴結(jié)中啟動(dòng)，這些功能對(duì)于利用抗PD-1治療的抗腫瘤反應(yīng)非常重要。
圖5：
為了清楚的揭示NSCLC的TME中髓系細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用，研究者將PIC-seq技術(shù)應(yīng)用于早期NSCLC病變的臨床樣本中進(jìn)行研究。研究者通過對(duì)早期未接受治療的手術(shù)切除的10例NSCLC組織，與鄰近未發(fā)生癌變的正常組織進(jìn)行了PIC-seq測(cè)序，構(gòu)建了NSCLC患者的PIC圖譜。隨后，研究者使用MetaCell算法將PIC-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，建立TME和健康組織中單細(xì)胞狀態(tài)的背景模型，同時(shí)根據(jù)基因表達(dá)將T細(xì)胞進(jìn)行分類：遷移T細(xì)胞，幼稚T細(xì)胞，增殖T細(xì)胞，CD4+激活T細(xì)胞，CD4+記憶T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，CD8+細(xì)胞毒性T和CD8+功能失調(diào)T細(xì)胞。緊接著，研究者同樣根據(jù)VCAN或CD31基因的表達(dá)情況將骨髓細(xì)胞分為單核細(xì)胞的兩個(gè)子集，并且將剩余的髓系細(xì)胞亞群分為四種樹突狀細(xì)胞亞型，即：表達(dá)DC的單核細(xì)胞基因、經(jīng)典DCI型樹突狀細(xì)胞、經(jīng)典DCII型細(xì)胞和富含免疫調(diào)節(jié)分子的成熟樹突狀細(xì)胞。
通過分析結(jié)果，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤組織和鄰近無腫瘤組織之間的細(xì)胞組成存在一致的差異，他們計(jì)算了每個(gè)標(biāo)本的TME與健康細(xì)胞狀態(tài)的比率，并量化了子集豐度之間的相關(guān)性。結(jié)果與之前對(duì)NSCLC病變的的單細(xì)胞分析一致，因此這個(gè)結(jié)果可以作為研究TME中定義細(xì)胞相互作用的分子程序的基線。
圖6：
進(jìn)一步的通過結(jié)合多重免疫熒光和其它技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)，表達(dá)CD4標(biāo)記（cluster determinant 4），PD-1（程序性死亡配體1）和CXCL13（C-X-C基序趨化因子配體13）的T細(xì)胞，是NSCLC腫瘤微環(huán)境中形成與抗原呈遞樹突狀細(xì)胞相互作用的主要樞紐。隨后，作者將這群新發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性很高，且基因相同（克隆）保守的T細(xì)胞命名為輔助性腫瘤T細(xì)胞（Tht）細(xì)胞。此外，研究者發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中Tht細(xì)胞比效應(yīng)CD8+T 細(xì)胞更傾向于與樹突狀細(xì)胞發(fā)生相互作用。
4. T細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的相互作用決定免疫治療效果
為了更好地了解Tht細(xì)胞在體內(nèi)的時(shí)空分布核分化動(dòng)態(tài)，作者利用小鼠模型，將B16-OVA細(xì)胞移植到WTC57BL/6J受體中。隨后在腫瘤注射后10天和17天，對(duì)從腫瘤引流淋巴結(jié)(tdLNs)和頸部周圍淋巴結(jié)(cLNs)中分離的12154個(gè)陽性單TCRβ+T細(xì)胞進(jìn)行MARS-seq測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗原特異性的CD45.1+TCRβ+OT-II T細(xì)胞上調(diào)了從體外研究中衍生的Tht細(xì)胞特征、tdLNCD45.1+TCRβ+OT-IIT細(xì)胞上調(diào)了T細(xì)胞激活特征、體內(nèi)Tht細(xì)胞特征與幼稚t細(xì)胞基因的表達(dá)減少相關(guān)，并與細(xì)胞周期基因的表達(dá)相關(guān)。
接下來，作者研究了Tht細(xì)胞的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，及其從tdln向TME遷移過程的工作機(jī)制。研究者收集并分析了內(nèi)源性TCRβ+ T細(xì)胞，并在第10和17天從TME過繼轉(zhuǎn)移OT-IICD45.1+ TCRβ+ T細(xì)胞，以及在腫瘤注射后第10天從tdLNs和clns的細(xì)胞。結(jié)果表明，與腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞顯著上調(diào)Tht相關(guān)的激活程序。
圖7：
接下來，為了進(jìn)一步研究Tht細(xì)胞的狀態(tài)是否和tdln中與DC的物理相互作用，特別是抗原提呈功能相關(guān)，在注射腫瘤細(xì)胞后的第10天，也就是Tht細(xì)胞在tdln中積累較多時(shí)，研究者從tdLNs和cln中分離3406個(gè)qc陽性cD11c+ 髓系細(xì)胞進(jìn)行了MARS-seq，并使用MetaCell算法對(duì)它們進(jìn)行分析。同時(shí)，為了更好地定義抗PD-1治療后Tht細(xì)胞的分子重編程，作者對(duì)腫瘤注射后17天內(nèi)來自過繼轉(zhuǎn)移小鼠tdln的2867個(gè)多克隆TCRβ+和OT-IICD45.1+TCRβ+T細(xì)胞進(jìn)行了MARS-seq。通過整合所有的分析結(jié)果，研究者證實(shí)Tht細(xì)胞直接參與了抗pd-1抗體的抗腫瘤療效，并揭示了mTht細(xì)胞在抗pd-1治療后的分子重編程功能機(jī)制。
圖8：
總的來說，這項(xiàng)研究首次利用PIC-seq技術(shù)揭示了人類NSCLC病灶中CD4+PD-1+CXCL13+ T細(xì)胞(Tht)與DC-LAMP+ mregDCs之間存在的相互作用。研究者首次發(fā)現(xiàn)Tht細(xì)胞在TME中優(yōu)先與DC相互作用，而不是效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞。同時(shí)，通過進(jìn)一步使用實(shí)驗(yàn)小鼠模型，作者揭示了Tht細(xì)胞的分化、擴(kuò)張和維持，與tdln和TME中的腫瘤抗原呈遞相關(guān)。PIC-seq在揭示細(xì)胞-細(xì)胞物理相互作用方面的無偏性為探索腫瘤免疫的復(fù)雜相互作用動(dòng)力學(xué)提供了意想不到的效果。這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明，TME種至少存在兩種不同的T細(xì)胞群，CD8+效應(yīng)/功能障礙T細(xì)胞和Tht細(xì)胞，它們通過克隆擴(kuò)展重塑TME，對(duì)腫瘤抗原呈遞做出特異性反應(yīng)。
然而，這項(xiàng)研究并沒有清楚的揭示Tht細(xì)胞在TME中與其他免疫細(xì)胞之間的結(jié)合作用，如Treg、效應(yīng)T、髓系細(xì)胞和NK細(xì)胞。在未來的研究中，如果能全面揭示這些Tht細(xì)胞如何通過和其它免疫細(xì)胞之間的相互作用，從而促進(jìn)或抑制腫瘤的免疫殺傷機(jī)制，特別是患者在免疫治療的過程中發(fā)生的相互作用，將會(huì)為我們更全面的認(rèn)識(shí)腫瘤微環(huán)境的工作機(jī)制提供重要依據(jù)。
5.展望
細(xì)胞之間的通訊交流不僅是組織維持發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，也是很多疾病發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)，包括腫瘤。在每個(gè)器官組織的功能部位，細(xì)胞通過物理空間上的相互結(jié)合作用進(jìn)行通訊，并交換代謝產(chǎn)物、配體-受體信號(hào)和形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。其中，免疫細(xì)胞參與了許多類型的物理相互作用，從而促進(jìn)組織修復(fù)、吞噬作用和細(xì)胞死亡等生理過程。在免疫系統(tǒng)中，T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的物理相互作用就是一個(gè)十分重要的范例。這種相互作用對(duì)于免疫系統(tǒng)區(qū)分自身和非自身的能力至關(guān)重要，當(dāng)CD4+ T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞發(fā)生物理相互作用時(shí)，會(huì)在T細(xì)胞受體上形成一個(gè)免疫突觸和在MHC-II分子上呈現(xiàn)抗原。根據(jù)T細(xì)胞受體對(duì)所呈遞抗原的親和力和共刺激分子的存在，這種相互作用可以激活胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)，從而導(dǎo)致特定的免疫決定。
盡管我們一直都清楚物理上相互接觸的細(xì)胞簇是一個(gè)功能單元，它們之間的直接相互作用是影響很多疾病，特別是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要決定因素。但目前對(duì)于體內(nèi)各種細(xì)胞與其它免疫細(xì)胞，尤其是T細(xì)胞核樹突狀細(xì)胞相互作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和串?dāng)_的表征仍然很困難。共培養(yǎng)的體外測(cè)定法或顯微鏡技術(shù)與具有不變T細(xì)胞受體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型相結(jié)合盡管有效，但在分辨率和背景方面有一定的限制。而單細(xì)胞RNA測(cè)序在組織解離的過程中會(huì)消除細(xì)胞結(jié)合物。因此，PIC-seq技術(shù)的提出就為我們提供了一種嶄新的手段直接研究在物理上存在相互作用的細(xì)胞之間的功能交流?；谶@項(xiàng)革命性的技術(shù)，即使通過消化會(huì)破壞掉組織原有的空間結(jié)構(gòu)，但我們?nèi)匀豢梢跃珳?zhǔn)捕獲到本身存在物理作用的細(xì)胞簇。
不過需要注意的是，目前使用PIC-seq技術(shù)進(jìn)行研究的文章主要都是由其開發(fā)者所在的以色列實(shí)驗(yàn)室所發(fā)表的，所以目前小編推測(cè)這種技術(shù)還沒有得到推廣。但是小編相信這種技術(shù)在未來會(huì)被商業(yè)化推廣，或者會(huì)有類似的技術(shù)被開發(fā)出來。同時(shí)，基于這種技術(shù)的數(shù)據(jù)和相應(yīng)軟件作者都已經(jīng)公開，大家可以挖掘已經(jīng)發(fā)表的PIC-seq數(shù)據(jù)來用于自己的研究中。
[參考文獻(xiàn)]
[1] Giladi A, Cohen M, Medaglia C, Baran Y, Li B, Zada M, Bost P, Blecher-Gonen R, Salame TM, Mayer JU, David E, Ronchese F, Tanay A, Amit I. Dissecting cellular crosstalk by sequencing physically interacting cells. Nat Biotechnol. 2020 May;38(5):629-637. doi: 10.1038/s41587-020-0442-2. Epub 2020 Mar 9. PMID: 32152598.
[2] Cohen M, Giladi A, Barboy O, Hamon P, Li B, Zada M, Gurevich-Shapiro A, Beccaria CG, David E, Maier BB, Buckup M, Kamer I, Deczkowska A, Le Berichel J, Bar J, Iannacone M, Tanay A, Merad M, Amit I. The interaction of CD4+ helper T cells with dendritic cells shapes the tumor microenvironment and immune checkpoint blockade response. Nat Cancer. 2022 Mar;3(3):303-317. doi: 10.1038/s43018-022-00338-5. Epub 2022 Mar 3. PMID: 35241835.
