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代謝重編程是腫瘤細(xì)胞的主要特征。由腫瘤微環(huán)境惡化驅(qū)動(dòng)的葡萄糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝重編程與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，近年來(lái)得到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。今天小編為大家解析的這篇文章就是以肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝重編程為側(cè)重點(diǎn)，基于生信信息學(xué)方法對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，進(jìn)一步揭示其潛在的細(xì)胞間的變化和可能的致病機(jī)理。這篇文章于今年3月發(fā)表于Communications Biology(IF = 6.268)。
一、摘要
本研究的主要目的是探究與肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝重編程，揭示其潛在的細(xì)胞間的變化。基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中394例LUAD患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，作者鑒定出11個(gè)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝基因，這些基因涉及在糖酵解和脂質(zhì)代謝途徑中。并且，研究通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)算法定義了3個(gè)代謝重編程表型：MP-I、MP-II、MP-III。在TCGA-LUAD隊(duì)列和6個(gè)GEO表達(dá)譜共計(jì)1235個(gè)樣本中，MP-III型樣本的糖解酶水平最高、脂質(zhì)代謝水平最低，并表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)移能力和較低的生存率。分析結(jié)果表明，TP53和KEAP1基因的突變以及SETD2和PBRM1的缺失可能是導(dǎo)致MP-III型患者代謝重編程的主要因素。LUAD樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證從正常到MP-II、MP-III，再到MP-I的代謝軌跡。細(xì)胞間通訊分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ANGPTL通路中MP-III型細(xì)胞群與內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有獨(dú)特的相互作用，而在VEGF通路中其與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用更強(qiáng)。鑒于此，研究認(rèn)為，糖酵解-脂質(zhì)失衡模式能夠?qū)е屡c轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝重編程表型。該研究為進(jìn)一步了解致癌驅(qū)動(dòng)因子和腫瘤微環(huán)境之間的相互作用提供參考，對(duì)于LUAD轉(zhuǎn)移的治療提供策略。
二、材料與方法
1. 數(shù)據(jù)來(lái)源
本研究中，作者從TCGA、GEO和CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)共獲取10個(gè)LUAD隊(duì)列。兩個(gè)轉(zhuǎn)移性LUAD數(shù)據(jù)集（TCGA-LUAD和GSE11969）的患者類(lèi)型包括遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移性。其中，TCGA-LUAD隊(duì)列共包括394例LUAD患者樣本（25例遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、160例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及209例非轉(zhuǎn)移性樣本）。此外，對(duì)于TCGA-LUAD和GSE11969這兩個(gè)數(shù)據(jù)集，作者分別下載了390和385個(gè)突變和拷貝數(shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)。GSE11969數(shù)據(jù)集共包括18個(gè)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、15個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和35個(gè)非轉(zhuǎn)移性LUAD樣本的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)。用于生存分析的5個(gè)LUAD表達(dá)譜，納入的標(biāo)準(zhǔn)為：手術(shù)切除后未接受輔助治療的I期患者樣本數(shù)要超過(guò)50例。
此外，作者選擇了2個(gè)LUAD單細(xì)胞表達(dá)譜數(shù)據(jù)：GSE131907和GSE123902。在GSE131907數(shù)據(jù)集中，作者從11位tLung患者、10位腦轉(zhuǎn)移患者和11個(gè)正常肺組織中共提取了208506個(gè)細(xì)胞。在GSE123902數(shù)據(jù)集中，作者從7位tLung患者的原發(fā)性組織中提取了18511個(gè)細(xì)胞。
2. 數(shù)據(jù)預(yù)處理
TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2000 platform，fpkm表達(dá)矩陣經(jīng)log2(x+1)轉(zhuǎn)換；對(duì)于單細(xì)胞表達(dá)譜（scRNA-seq）數(shù)據(jù)，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2500。將基因的Ensembl ID轉(zhuǎn)換成symbol。芯片數(shù)據(jù)GSE31210、GSE50081和GSE68465，測(cè)序平臺(tái)為Affymetrix；GSE42127數(shù)據(jù)集測(cè)序平臺(tái)為Illumina、GSE13213測(cè)序平臺(tái)為Agilent。體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)從Illumina Genome Analyzer DNA Sequencing GAIIx平臺(tái)獲取，包含17821個(gè)非同義突變?？截悢?shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)使用GISTIC算法進(jìn)行處理。
3. 差異分析、富集分析
差異基因的鑒定使用student’s t-test，基于超幾何分布模型對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，數(shù)據(jù)集來(lái)源于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）。
4. 代謝重編程表型的鑒定
首先，作者基于代謝相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)性使用層次聚類(lèi)的方法將患者分成不同的簇（或組）。在聚類(lèi)之前，去除掉表達(dá)量均為0的樣本或細(xì)胞，并對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行歸一化處理。接下來(lái)，作者通過(guò)公式計(jì)算MP-score以評(píng)估不同簇的患者之間糖酵解和脂代謝基因之間的表達(dá)差異。計(jì)算公式如下：
5. 相關(guān)性及生存分析
使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估不同簇患者之間缺氧評(píng)分、干性評(píng)分、增殖評(píng)分、免疫評(píng)分和腫瘤突變負(fù)荷（TMB）的差異?；蜷g的表達(dá)相似性、突變情況、拷貝數(shù)變異（CNV）和蛋白表達(dá)情況使用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行評(píng)估。生存時(shí)間被定義為從最初的手術(shù)切除到死亡或最近一次隨訪的時(shí)間。使用Kaplan–Meier法繪制生存曲線(xiàn)。使用單因素cox模型分析患者的生存狀態(tài)與臨床特性之間的相關(guān)性。
6. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
基于前20個(gè)主成分，使用R package Seurat中的RunPCA和JackStraw函數(shù)來(lái)對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)。使用RunUMAP函數(shù)對(duì)聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行可視化。使用Featureplot函數(shù)對(duì)每個(gè)細(xì)胞中mRNA的平均表達(dá)水平進(jìn)行可視化。使用SingleR對(duì)單細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行注釋。使用R package CellChat分析細(xì)胞間通訊。配體-受體互作及其相關(guān)的信號(hào)通路從CellChat數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.cellchat.org）下載。該方法是根據(jù)兩個(gè)細(xì)胞群間的基因表達(dá)、信號(hào)因子和細(xì)胞百分比來(lái)推斷配體-受體間的潛在相關(guān)作用強(qiáng)度。
三、結(jié)果
3.1 鑒定LUAD轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝重編程表型
首先，基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，使用Student’s t-test方法進(jìn)行差異分析（篩選標(biāo)準(zhǔn)為：FDR < 0.05），在轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移性LUAD樣本間共鑒定出431個(gè)差異基因，其中，顯著下調(diào)表達(dá)基因151個(gè)，顯著上調(diào)表達(dá)基因280個(gè)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)基因顯著富集到HIF-1信號(hào)通路，該通路是糖酵解途徑中的重要通路。先前的研究發(fā)現(xiàn)，該通路能夠通過(guò)激活糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)增強(qiáng)糖酵解作用，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。相比之下，下調(diào)表達(dá)基因顯著富集到脂代謝相關(guān)的生物途徑，包括甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）和醚脂代謝（Ether lipid metabolism）等。由此作者推測(cè)，糖代謝和脂代謝可能在誘導(dǎo)LUAD轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演不同的角色（圖1 a-c）。
因此，作者將顯著富集到糖酵解/糖異生（Glycolysis/Gluconeogenesis）途徑的8個(gè)下調(diào)基因（ALDOA, ENO1, GAPDH, GPI, LDHA, PGAM1, PGM2, TPI1）以及顯著富集到甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）和醚脂代謝（Ether lipid metabolism）這兩個(gè)脂代謝通路的3個(gè)上調(diào)基因（PLPP1, GPD1L, PLD3）提取出來(lái)，進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。
首先，作者基于上述11個(gè)基因在全部LUAD患者樣本中的表達(dá)模式進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)。分析結(jié)果將全部LUAD患者劃分成3個(gè)簇（圖1 d），由于這些基因的表達(dá)模式與糖、脂代謝途徑顯著相關(guān)，因此作者將這些簇定義為代謝重編程表型（metabolic reprogramming phenotypes, MPs）。接下來(lái)，作者計(jì)算了每個(gè)簇的MP得分，并根據(jù)得分的由低到高將簇分別命名為：MP-I、MP-II、MP-III。通過(guò)構(gòu)建混淆矩陣，作者發(fā)現(xiàn)，MP-I型樣本的患者類(lèi)型主要為轉(zhuǎn)移性，MP-II型樣本的患者類(lèi)型主要為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性，而MP-III型樣本的患者類(lèi)型主要為遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移性（圖1 f）。此外，生存分析結(jié)果表明，MP-III患者的生存率顯著低于MP-I和MP-II患者（圖1 g）。
3.2 不同代謝表型的分子特性和臨床性狀差異
分析結(jié)果表明，MP-III型患者處于stage IV和stage III的比例顯著高于MP-I和MP-II。此外研究發(fā)現(xiàn)，從MP-I ~ III，患者的缺氧評(píng)分、干性評(píng)分和增殖評(píng)分逐漸增加。MP-II型患者的免疫評(píng)分最高，而MP-III型患者的免疫評(píng)分最低，兩者之間的免疫評(píng)分存在顯著差異（p < 0.0001）,見(jiàn)圖2。
3.3 LUAD代謝表型的驗(yàn)證
上述結(jié)果表明，MP-III型大多為未發(fā)生任何轉(zhuǎn)移的早期患者。由此推斷，這些患者可能會(huì)有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致較差的預(yù)后。因此，作者首先基于11個(gè)代謝基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)來(lái)自5個(gè)公共數(shù)據(jù)集的stage I患者進(jìn)行層次聚類(lèi)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，stage I患者也可聚類(lèi)為3種表型（圖3 a-e）。生存分析結(jié)果表明，在GSE31210、GSE50081、GSE13213、GSE42127數(shù)據(jù)集中，MP-III型的stage I患者生存率均顯著低于MP-I和MP-II型。除此之外，作者發(fā)現(xiàn)，在全部五個(gè)數(shù)據(jù)集中，MP-I和MP-II型的生存差異并不顯著，但是可以看出在GSE13213、GSE42127和GSE68465這3個(gè)數(shù)據(jù)集中，相較于MP-I型，MP-II型患者的生存率是偏低的，但差異并不顯著。
此外，研究從CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了110例LUAD患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從蛋白水平上評(píng)估11個(gè)代謝基因的表達(dá)模式。從分析結(jié)果中可以看到，基于11個(gè)代謝基因的蛋白表達(dá)譜，同樣將110例LUAD患者聚成了3個(gè)表型。此外，研究觀察到每個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)（圖4）。
3.4 在單細(xì)胞水平上描述代謝表型的轉(zhuǎn)錄軌跡
基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)集GSE131907，26436個(gè)上皮細(xì)胞被分成了14個(gè)簇，其中包括正常細(xì)胞簇（Cluster 1、11、13）、原代腫瘤細(xì)胞簇（Cluster 4、8、9、10）、腦轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞簇（Cluster 0、2、3、5、6、7、12），見(jiàn)圖5 a。圖5 b表現(xiàn)為每個(gè)細(xì)胞中11個(gè)代謝基因的平均表達(dá)水平。接下來(lái)，作者基于11個(gè)基因的表達(dá)矩陣對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)以確定上皮腫瘤細(xì)胞的代謝表型，分析結(jié)果表明，MP-III型患者的腦轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的比例顯著高于MP-I和MP-II型（圖5 e）。
接下來(lái)，作者根據(jù)11個(gè)代謝基因的mRNA表達(dá)變化對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行排序，以構(gòu)建代謝軌跡。軌跡中的7個(gè)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)分別代表不同的細(xì)胞代謝軌跡。每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)中各表型所占比例見(jiàn)圖5 f，可以很明顯的看出，正常上皮細(xì)胞顯著富集在state 1和state 4這兩個(gè)狀態(tài)，然而，處于state 4階段的細(xì)胞11個(gè)代謝基因的表達(dá)水平普遍較低，這一點(diǎn)在TCGA數(shù)據(jù)集中并沒(méi)有觀察到。糖-脂質(zhì)代謝失衡的代謝軌跡似乎主要是從部分正常上皮細(xì)胞開(kāi)始的，主要在State 1末期分化成MP-I型腫瘤細(xì)胞，然后形成一個(gè)具有兩個(gè)主要細(xì)胞命運(yùn)的分支結(jié)構(gòu)：Cell fate 1和Cell fate 2。通過(guò)追蹤C(jī)ell fate 1的代謝軌跡，作者發(fā)現(xiàn)MP-I型腫瘤細(xì)胞逐漸分化成MP-III型（state 3）。此外，對(duì)Cell fate 2代謝軌跡的追蹤結(jié)果表明，MP-II和MP-III型腫瘤細(xì)胞主要富集在State 6和State 7這兩個(gè)獨(dú)立的分支。
3.5 揭示代謝表型下潛在的細(xì)胞間通訊
在該部分分析中，作者從患者原發(fā)性腫瘤組織中提取6372個(gè)腫瘤上皮細(xì)胞、2373個(gè)干細(xì)胞和35506個(gè)免疫細(xì)胞。如圖5 a所示，作者在10個(gè)細(xì)胞群兩兩間共鑒定出41個(gè)具顯著意義的配體-受體對(duì)。正如所推斷的那樣，作者發(fā)現(xiàn)MP-III型細(xì)胞群表現(xiàn)出強(qiáng)烈的信號(hào)輸出，其次為MP-II和MP-I型細(xì)胞群（圖6 b）。
接下來(lái)，與3種代謝表型相關(guān)的重要配體-受體對(duì)被進(jìn)一步劃分為15個(gè)信號(hào)通路（圖6 c）。各配體-受體對(duì)在信號(hào)通路中的相對(duì)貢獻(xiàn)率以及在各細(xì)胞群中的作用如圖6 b、c所示。此外，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3個(gè)MP細(xì)胞群中，MP-II是EGF信號(hào)通路的主要受體，可能單獨(dú)發(fā)揮作用，也可能是與髓細(xì)胞、MAST、NK和內(nèi)皮細(xì)胞共同作用（圖7 g-i）。
四、總結(jié)
在本研究中，分析結(jié)果表明在轉(zhuǎn)移性LUAD樣本中顯著上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的差異基因分別富集在糖酵解和脂代謝途徑中，由此推測(cè)糖脂代謝的失衡可能會(huì)促進(jìn)LUAD的轉(zhuǎn)移。不足之處在于，（1）首先，本研究是基于11個(gè)代謝基因的mRNA表達(dá)譜來(lái)定義代謝表型的，因此，糖酵解和脂質(zhì)代謝活性需要通過(guò)估計(jì)其代謝物來(lái)驗(yàn)證；（2）其次，在本研究中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間相互作用應(yīng)使用更多的方法來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，因?yàn)樗鼈兪峭ㄟ^(guò)配體及其受體的mRNA表達(dá)預(yù)測(cè)的；（3）盡管MP-III群體與其他群體的相互作用在另一個(gè)scRNA seq數(shù)據(jù)集中得到了驗(yàn)證，但想要獲得更可靠的結(jié)果仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；（4）此外，其他改變腫瘤微環(huán)境的代謝重編程模式，如代謝物等，仍待進(jìn)一步探究?？偟膩?lái)說(shuō)，研究鑒定了可能與LUAD轉(zhuǎn)移相關(guān)的三種代謝表型，發(fā)現(xiàn)這一代謝重編程背后的四種致癌事件及其與其他細(xì)胞間的相互作用（尤其是ANGPTL信號(hào)通路）為防止LUAD轉(zhuǎn)移提供了候選治療策略。
