m6A甲基化居然能和鐵死亡聯(lián)合?。。?/h1>

m⁶A甲基化是最近的熱點(diǎn)，其最大的特點(diǎn)之一就是易于和自己的課題結(jié)合。這篇文章的亮點(diǎn)在于我第一次系統(tǒng)地研究了m⁶A甲基化和鐵死亡的結(jié)合，并建立了較完善的研究方法，對大家的研究啟發(fā)很大。甚至可以模仿或套用。

m⁶A和鐵死亡相關(guān)的基礎(chǔ)知識

磨刀不誤砍柴工，在進(jìn)入正題之前一定要先看看m⁶A和鐵死亡相關(guān)的基礎(chǔ)知識。N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A）是真核生物最常見和最豐富的RNA分子修飾。從發(fā)育和代謝到生殖。m⁶A存在于很多物種質(zhì)中，占到了RNA堿基甲基化修飾的80%。m⁶A主要分布在mRNA中，也出現(xiàn)在非編碼RNA如tRNA， rRNA和snRNA。在轉(zhuǎn)錄成的RNA中相對高的m⁶A含量會影響RNA的代謝過程，比如剪切，核轉(zhuǎn)運(yùn)，翻譯能力和穩(wěn)定性，以及RNA轉(zhuǎn)錄。說的這么正式，我總結(jié)一下：m⁶A非常常見，你所研究的疾病或表型很有可能涉及。

下圖帶你全面了解m⁶A動態(tài)過程。

M6A修飾是一個(gè)高度動態(tài)和可逆的過程，涉及到負(fù)責(zé)安裝稱為“Writers”的修飾、移除稱為“Erasers”的甲基化和識別稱為“Readers”的修飾的酶(圖1)。每一類調(diào)節(jié)器的都可以發(fā)揮作用，以維持細(xì)胞內(nèi)m6A水平的穩(wěn)態(tài)平衡¹。

 

Writers：在RNA加上甲基，介導(dǎo)RNA的甲基化修飾過程。干這活的是甲基轉(zhuǎn)移酶，最常見的分子是METTL3和METTL14，兩者可在體外和體內(nèi)催化mRNA（和其他細(xì)胞核RNA）的m⁶A甲基化。WTAP是這種甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的另一個(gè)關(guān)鍵組分。

Erasers：將RNA上甲基去除，介導(dǎo)RNA的去甲基化修飾過程。FTO和ALKBH5可以去除mRNA（和其他細(xì)胞核RNA）上的m⁶A甲基化。

Readers：識別RNA甲基化修飾的信息，并參與下游RNA的翻譯、降解等過程。比如，YTHDC1可與mRNA上的m⁶A修飾，促進(jìn)mRNA出核運(yùn)輸與可變剪接。YTHDF1/YTHDF3識別m⁶A后可促進(jìn)mRNA的翻譯，而YTHDF2與m⁶A的結(jié)合則會促進(jìn)mRNA的降解。

m⁶A思路中關(guān)鍵技術(shù)手段：

M⁶A-seq和MeRIP-seq測序方法建立于2012年。技術(shù)原理是使用特異性抗體富集m⁶A修飾的RNA片段，將mRNA隨機(jī)片段化，進(jìn)行高通量測序。MeRIP-Seq/m⁶A-seq 需要構(gòu)建兩個(gè)文庫：MeRIP-Seq/m⁶A-seq文庫（IP，免疫沉淀）和 RNA-seq文庫（input，對照）。

其中LC-MS/MS和比色法能夠檢測mRNA整體的m⁶A水平，在這里我自己的實(shí)驗(yàn)用的是比色法，我也更推薦比色法，雖然比色法與LC-MS/MS比較相似，也是從整體水平上檢測RNA上m⁶A甲基化水平。相對于LC-MS/MS較為繁瑣的操作，比色法更為簡便。研究人員既可以提取totAl RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。還有對應(yīng)的試劑盒可以使用，其核心原理與ELISA反應(yīng)類似，經(jīng)過優(yōu)化后檢測m⁶A靈敏度也高。

還有一項(xiàng)必備的驗(yàn)證試驗(yàn)用來驗(yàn)證甲基化相關(guān)酶與關(guān)鍵基因結(jié)合：所謂m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR，即利用m6A抗體在富集到帶甲基化修飾的RNA后，下一步使用qPCR直接對富集到的RNA進(jìn)行定量的一種技術(shù)。這種技術(shù)可以做到對發(fā)生甲基化的RNA進(jìn)行相對定量，是一種低成本的檢測方法，僅需m6A抗體，A/G免疫磁珠，磁力架和qPCR儀及配套試劑盒即可開展這類實(shí)驗(yàn)。

 

鐵死亡

鐵死亡（ferroptosis）是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞死亡方式，其特征是脂質(zhì)過氧化物和活性氧(ROS)的過量蓄積。由于該過程依賴鐵，所以被稱為鐵死亡。鐵死亡不僅與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其相關(guān)信號通路上的關(guān)鍵蛋白也可成為藥物的作用靶點(diǎn)。鐵死亡的的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物的代謝障礙，進(jìn)而在鐵離子的催化下異常代謝，產(chǎn)生大量脂質(zhì)，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，攻擊生物大分子，觸發(fā)細(xì)胞的死亡²。

 

上圖看起來復(fù)雜，但是還是有思路可循，我把其思路進(jìn)行梳理變化成相關(guān)的鐵死亡的特點(diǎn)

 

根據(jù)這些鐵死亡的特點(diǎn)，也就衍生出對應(yīng)的研究工具出現(xiàn)

形態(tài)觀察：透射電鏡直接對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察：細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)線粒體變小以及線粒體膜密度較大；

活性氧水平：細(xì)胞內(nèi)活性氧和脂質(zhì)活性氧通過流式細(xì)胞術(shù)使用DCFH-DA和C11-BODIPY 熒光探針（購買試劑盒）檢測

細(xì)胞活性檢測“”MTT/CCK8檢測細(xì)胞活性

鐵水平檢測：可以使用PGSK探針，流式細(xì)胞術(shù)或共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鐵含量的細(xì)胞膜透性染料；或者使用Iron AssAy Kit（試劑盒）檢測細(xì)胞、組織中的鐵水平

線粒體膜電位檢測：通過流式細(xì)胞儀收集TMRE陽性細(xì)胞的比例

qRT-PCR/Western blot檢測：檢測細(xì)胞內(nèi)與鐵死亡相關(guān)的因子的變化，例如COX-2，ACSL4，PTGS2，NOX1，GPX4和FTH1等，其中COX-2，ACSL4，PTGS2和NOX1在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；GPX4和FTH1在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

下面我們進(jìn)入正題：

這次我主要給大家?guī)韮蓚€(gè)思路，這兩個(gè)思路的特點(diǎn)是簡單好上手換個(gè)疾病就是一篇SCI。

• 先有蛋再有雞

這里蛋和雞自然指的就是m⁶A甲基化和鐵死亡。第一種思路是先發(fā)現(xiàn)m⁶A甲基化再去聯(lián)系鐵死亡：m⁶A甲基化關(guān)鍵酶可以誘導(dǎo)鐵死亡

1、m⁶A甲基化及其關(guān)鍵酶改變

首先我們得確定研究的疾病或者表型是否有m⁶A甲基化及其關(guān)鍵酶差異表達(dá)。舉個(gè)例子：在這里作者³的結(jié)果表明，BPQD暴露（處理組）增加了肺細(xì)胞中整體RNA m⁶A的水平，這可能與去甲基酶ALKBH5的下調(diào)有關(guān)。

 

2、然后作者將處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表位轉(zhuǎn)錄組的變化

這步就是具體研究哪些甲基化相關(guān)酶發(fā)生變化，有沒有具體的位點(diǎn)。

這些結(jié)果表明，RNA m⁶A表位轉(zhuǎn)錄組確實(shí)受到處理方式對肺細(xì)胞的生物學(xué)影響。并且這種影響很有可能和眾所周知，脂氧合酶途徑、對硒離子的反應(yīng)以及脂肪酸代謝過程密切相關(guān)。鐵死亡是一種新的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的形式。它通常是由嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽(GSH)耗竭和鐵超載引起。在死亡細(xì)胞中，線粒體的形態(tài)發(fā)生了很大的變化，包括體積變小，嵴減少，膜濃縮，外膜破壞。在這里，作者通過外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)處理方式可能引發(fā)肺細(xì)胞的鐵死亡。

接下來作者繼續(xù)探索機(jī)制和下游的影響這是文章深度的關(guān)鍵！ALKBH5基因敲除增加m⁶A并加重處理誘導(dǎo)的鐵死亡。這些結(jié)果表明，處理組通過抑制ALKBH5的表達(dá)而引發(fā)肺細(xì)胞鐵死亡。

無獨(dú)有偶，在另一篇文章⁴中作者也發(fā)現(xiàn)YTHDC2誘導(dǎo)了LUAD細(xì)胞內(nèi)源性鐵死亡。

在這里作者選用了過表達(dá)m⁶A甲基化關(guān)鍵酶閱讀器YTHDC2，作者在這里一定是做了相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，才精準(zhǔn)的確定了YTHDC2的作用，我個(gè)人更傾向于于用生信的方法去篩選，不僅可以提升文章的檔次，還可以增加成功的概率。作者發(fā)現(xiàn)YTHDC2在H1299和H1975細(xì)胞中不受經(jīng)典鐵死亡誘導(dǎo)劑和抑制劑如erAstin、RSL3、Fer-1和DFO的影響，表明YTHDC2是一種獨(dú)立的內(nèi)源性體外死亡誘導(dǎo)劑，發(fā)揮著經(jīng)典鐵死亡誘導(dǎo)劑或抑制劑不可替代的作用。

有沒有感覺到很熟悉，相似的思路和套路。不僅如此還可以進(jìn)階做一些機(jī)制實(shí)驗(yàn)。比如：線粒體和抗氧化基因mRNAs的m⁶A修飾被YTHDF2識別。還可以分別從MeRIPseq和RNA-seq的數(shù)據(jù)中對差異m⁶A峰與其相應(yīng)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。根據(jù)RNA-seq分析YTHDF2在許多類型的細(xì)胞或組織中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯、衰變和清除。然后，還可以用RNA免疫沉淀(RIP)qPCR方法檢測了YTHDF2的候選靶向mRNA及其在處理后的變化。

這樣就進(jìn)一步增加了機(jī)制的研究文章的檔次也就上去了。

• 先有雞再有蛋

第一種思路是先通過m⁶A甲基化來與鐵死亡相關(guān)聯(lián)，第二種思路⁵自然是先有鐵死亡再有m⁶A甲基化。臨床前和臨床藥物(如索拉非尼和Erastin)可以誘導(dǎo)HSC鐵死亡。m⁶A修飾是否參與HSC鐵死亡的調(diào)節(jié)？為了測試這種潛在的可能性。

1、作者首先檢測了HSC鐵死亡期間m⁶A的修飾水平。引人注目的是，m⁶A rnA甲基化定量分析和斑點(diǎn)印跡顯示，索拉非尼、erastin和RSL3治療后m⁶A修飾水平顯著增加。接下來就是苦力活了，驗(yàn)證幾種甲基化的關(guān)鍵酶，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候已經(jīng)證明了甲基化的變化。在HSC鐵死亡中，METTL4而不是其他甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白導(dǎo)致mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而FTO而不是其他去甲基化酶的水平顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，HSC鐵死亡時(shí)m⁶A的修飾增加是由于Writers METTL4和Erasers FTO的失調(diào)所致。

 

由于所以利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染METTL4 shRNA或FTO質(zhì)粒的HSC-Lx2細(xì)胞，研究上調(diào)的m⁶A修飾是否直接參與了鐵死亡的誘導(dǎo)。經(jīng)費(fèi)不足可選擇一個(gè)做就可里啦。m⁶A RNA甲基化定量分析證實(shí)，METTL4基因敲除和FTO過表達(dá)均可完全減弱Erastin誘導(dǎo)的HSC-Lx2細(xì)胞m⁶A修飾上調(diào)此外，METTL4 shRNA或FTO質(zhì)?？娠@著解除Erastin和索拉非尼對HSC-Lx2和HSC-T⁶細(xì)胞的生長抑制?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，鐵死亡誘導(dǎo)治療上調(diào)m⁶A修飾可能有助于HSC鐵死亡。說到底就是驗(yàn)證試驗(yàn)，當(dāng)然這步也是必不可少的。

 

但是這樣還達(dá)不到一定的深度，到不了5+。因?yàn)闄C(jī)制還差了點(diǎn)，那就是m⁶A修飾是通過那些途徑引導(dǎo)鐵死亡的？總不能一個(gè)一個(gè)猜吧。這個(gè)時(shí)候篩基因當(dāng)然有請進(jìn)一步的RNA測序(RNA-seq)，進(jìn)一步探討m⁶A修飾促進(jìn)HSC鐵死亡的分子機(jī)制，并確定參與谷氨酰胺代謝途徑、非經(jīng)典自噬途徑和經(jīng)典鐵代謝途徑的靶基因。重要的是，KEGG的分析和GO分析充分表明，在HSC鐵死亡過程中，自噬信號可能受到m⁶A修飾的調(diào)節(jié)。此外，m⁶A RNA免疫沉淀(MERIP)qPCR顯示，HSC鐵死亡患者BECN1的m⁶A修飾水平增加，而ATG3、ATG4A、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG12和ATG1⁶L1的m⁶A修飾水平無明顯變化。一致地，用FTO質(zhì)粒或METTL4 shRNA減少m⁶A修飾后，BECN1的蛋白表達(dá)顯著降低，而其他自噬相關(guān)基因沒有明顯差異?？傊@些數(shù)據(jù)表明，m⁶A修飾誘導(dǎo)的鐵死亡與自噬激活有關(guān)。做到這些已經(jīng)可以輕松駕馭5+了~

 

全文總結(jié)：

以上，大家是否感覺m⁶A結(jié)合鐵死亡這種強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的文章也不是很難呢？這篇文章的亮點(diǎn)在于我第一次系統(tǒng)地研究了m⁶A甲基化和鐵死亡的結(jié)合，并建立了較完善的研究方法，對大家的研究啟發(fā)很大。做基礎(chǔ)研究的的基本思路之一就是發(fā)現(xiàn)某種現(xiàn)象、表型等，然后分析探討其背后的原因。一件復(fù)雜的事物中往往蘊(yùn)含著簡單規(guī)律，無論是學(xué)習(xí)科研還是做科研也都是有規(guī)律可循。今天我借借用幾篇文章一窺普通科研思路套路的升華過程。

正如我開頭所說因?yàn)閙⁶A會涉及大多數(shù)疾病和表型，所以不用太擔(dān)心你研究的內(nèi)容沒有m⁶A修飾。并且根據(jù)我的檢索這類文章非常少，你還不抓緊時(shí)間上車~

 

參考文獻(xiàn)：

1. Uddin MB, Wang Z, Yang C. The m(6)A RNA methylation regulates oncogenic signaling pathways driving cell malignant transformation and carcinogenesis. Mol Cancer 2021; 20(1): 61.

2. Jiang X, Stockwell BR, Conrad M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol 2021; 22(4): 266-82.

3. Ruan F, Zeng J, Yin H, et al. RNA m6A Modification Alteration by Black Phosphorus Quantum Dots Regulates Cell Ferroptosis: Implications for Nanotoxicological Assessment. Small Methods 2021; 5(3): e2001045.

4. Ma L, Zhang X, Yu K, et al. Targeting SLC3A2 subunit of system XC(-) is essential for m(6)A reader YTHDC2 to be an endogenous ferroptosis inducer in lung adenocarcinoma. Free Radic Biol Med 2021; 168: 25-43.

5. Shen M, Li Y, Wang Y, et al. N(6)-methyladenosine modification regulates ferroptosis through autophagy signaling pathway in hepatic stellate cells. Redox Biol 2021; 47: 102151.