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胃癌(gastric cancer, GC)包括許多分子亞型，是全球第五大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)對其發(fā)生發(fā)展起到至關(guān)重要的調(diào)控作用，因此小編今天就和大家分享一篇今年8月剛剛發(fā)表在Nature Communications（IF:17.694）雜志上刻畫胃癌TME的單細(xì)胞分析文章，文章對胃癌微環(huán)境中的細(xì)胞通訊進(jìn)行了研究并揭示了不同的T細(xì)胞耗竭軌跡，是一篇十分值得參考的使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)研究腫瘤微環(huán)境的文章。
scRNA-seq of gastric tumor shows complex intercellular interaction with an alternative T cell exhaustion trajectory
胃癌單細(xì)胞測序揭示復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用與不同的T細(xì)胞耗竭軌跡
一．研究背景
盡管早期胃癌有較高的治愈率，但大多數(shù)胃癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期或轉(zhuǎn)移期，他們的預(yù)后相對較差。此外，雖然目前針對PD-1和CTLA4的免疫治療已經(jīng)轉(zhuǎn)變了許多癌癥的治療模式，但其在胃癌中的應(yīng)答率仍然相對較低，因此迫切需要對胃癌進(jìn)行深入研究來開發(fā)有效的治療策略。許多先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性和細(xì)胞組成的個(gè)體差異與生存密切相關(guān)，而單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)能夠在更高的分辨率下解析GC的微環(huán)境，因此這篇文章作者就應(yīng)用scRNA-seq來繪制GC的免疫、基質(zhì)及上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄景觀并進(jìn)行了細(xì)致分析，希望能夠貢獻(xiàn)于GC腫瘤微環(huán)境和生物學(xué)特性的研究以及GC干預(yù)措施的開發(fā)。
二．文章摘要
研究對10例胃癌患者的腫瘤、癌旁組織及血液樣本的166533個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞(TASCs)的Wnt信號(hào)和血管生成活性上調(diào)，并且與生存呈負(fù)相關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和LAMP3+ 樹突狀細(xì)胞（DC）能夠參與介導(dǎo)T細(xì)胞活性，并與TASCs細(xì)胞相互作用?？寺⌒秃蛙壽E分析則發(fā)現(xiàn)Tc17 細(xì)胞(IL-17+ CD8+ T細(xì)胞)起源于組織駐留的記憶T細(xì)胞，并會(huì)分化為耗竭T細(xì)胞，這揭示了T細(xì)胞耗竭的另一種軌跡。研究也發(fā)現(xiàn)IL17+細(xì)胞可能通過IL17, IL22和IL26信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
三．主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 胃癌微環(huán)境的單細(xì)胞圖譜
在文章的第一部分作者在單細(xì)胞分辨率下對胃癌(GC)的細(xì)胞類型多樣性進(jìn)行了研究。研究納入10例未經(jīng)治療的原發(fā)性GC患者，并使用從腫瘤組織、外周血及癌旁組織中分離出的細(xì)胞構(gòu)建了單細(xì)胞測序譜(圖1a)。此外，作者也對樣本組織進(jìn)行了全外顯子測序(WES)和RNA測序。在整合患者表達(dá)譜及質(zhì)控后，研究最終保留了166533個(gè)細(xì)胞(圖1b)。接下來，作者將這些細(xì)胞劃分為屬于免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的12個(gè)譜系(圖1b-d)，觀察到幾乎所有細(xì)胞類型均在每個(gè)患者中都有發(fā)現(xiàn)，其中大部分來源于患者GC07、GC08和GC10（圖1e）。研究也獲取了配對的TCR和BCR (T/B細(xì)胞受體)測序數(shù)據(jù)，來研究不同T或B細(xì)胞亞型內(nèi)的狀態(tài)轉(zhuǎn)換。
2. GC中的惡性細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性
在文章的第二部分，作者對GC中的惡性細(xì)胞進(jìn)行了分析。作者首先提取上皮細(xì)胞并重新聚類，并根據(jù)腫瘤和正常組織的特征基因表達(dá)情況計(jì)算的腫瘤評(píng)分(圖2a)，及通過inferCNV計(jì)算細(xì)胞的拷貝數(shù)變異(CNV)得分(圖2b)，以及通過比較腫瘤組織與癌旁組織的WES數(shù)據(jù)識(shí)別的腫瘤特異性突變(圖2c)，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)模式(圖2f)，定義了正常簇、腫瘤細(xì)胞簇（圖2d）。接著作者研究了同一例患者組織測序數(shù)據(jù)是否有相似的基因表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)scRNA-seq和組織RNA-seq數(shù)據(jù)基因表達(dá)高度相關(guān)(圖2e)。接下來，作者研究了腫瘤和癌前病變簇的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)CLDN3、CLDN4和CLDN7在腫瘤細(xì)胞和腸化生（IM）細(xì)胞中異常高水平表達(dá)(圖2f)，且高變異基因平均表達(dá)量的相關(guān)性分析也表明Tumor_GC07和Tumor GC10簇彼此接近(圖2g)。此外，作者結(jié)合(Genotype-Tissue Expression, GTEx)數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)其共享一些食管黏膜腫瘤的特異性差異基因（DEGs）(圖2h, i)，且他們在除Tumor_GC08_1外的腫瘤簇中均表達(dá)下調(diào)(圖2j, k)。
3. 識(shí)別驅(qū)動(dòng)腸化生(IM)的潛在調(diào)控因子
由于上述識(shí)別到了IM簇，因此在這一部分作者對患者的IM進(jìn)行了分析。作者首先根據(jù)細(xì)胞類型特異基因計(jì)算了單細(xì)胞簇及組織中杯狀細(xì)胞和腸細(xì)胞評(píng)分(圖2l, m)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GC08和GC09腫瘤樣本和癌旁樣本中均有較高水平的IM。接著作者對驅(qū)動(dòng)IM的潛在調(diào)控因子進(jìn)行研究，來尋找與IM的主轉(zhuǎn)錄因子CDX2表達(dá)相關(guān)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDX2高度相關(guān)的基因包括已知的CDX2靶點(diǎn)，如GUCY2C、CDH17、SI和GPA33等(圖2n)。此外，作者還用胃癌細(xì)胞系進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HOXA13可以上調(diào)CDX2。
4. GC中機(jī)制組成經(jīng)歷了大量重塑
在這一部分，作者對胃癌TME中基質(zhì)細(xì)胞的功能進(jìn)行了分析。首先重新聚類了所有的基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌旁和腫瘤組織之間有明確分離，這表明TME中的基質(zhì)細(xì)胞與癌旁組織中相比發(fā)生了全面的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化(圖3a)。然后，作者將這些基質(zhì)細(xì)胞分為12個(gè)不同的簇，發(fā)現(xiàn)Endo_1、Fib_1和SMC_1主要富集在腫瘤組織中(圖3b)。作者也發(fā)現(xiàn)胃中內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)ⅱ類基因，如HLA-DRA和HLA-DRB5(圖3c)，這一點(diǎn)也被胃癌患者腫瘤切片的免疫組織化學(xué)(IHC)染色證實(shí)(圖3d)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)Endo_1具有下調(diào)的MHCⅱ類基因(圖3f)，進(jìn)一步對另外9個(gè)GC患者樣本進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)也發(fā)現(xiàn)腫瘤旁組織中MHC II類內(nèi)皮的比例高于對照組（圖3g）。同樣，作者進(jìn)行了IHC染色，來驗(yàn)證腫瘤中FAP+成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的存在(圖3e)。作者也發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路中的基因如WNT2和WNT5A在腫瘤成纖維細(xì)胞中上調(diào)，而抑制Wnt信號(hào)通路的SFRP1下調(diào)(圖3i)。這些基因在TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中也顯示出相似的表達(dá)模式(圖3j)。此外作者也觀察到促進(jìn)腫瘤生長和血管生成的BMP1和ANGPT2在SMC_1中表達(dá)水平顯著升高，免疫組化結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn)(圖3h)。此后，作者將三種腫瘤富集細(xì)胞簇Endo_1、Fib_1和SMC_1中的細(xì)胞定義為腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞(TASCs)。作者觀察到，腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵標(biāo)志血管生成通路在TASCs中顯著上調(diào)(圖3k)。然后，作者研究了TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中TASCs的比例和患者生存期之間的潛在關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fib_1和SMC_1均與較差的預(yù)后相關(guān)(圖3l)。此外，體外實(shí)驗(yàn)還表明，CAFs來源的上清液對幾種胃癌細(xì)胞系具有支持腫瘤生長的能力(圖3m)。綜上所述，作者推測TASCs在胃癌中發(fā)生了顯著的重塑并顯示出潛在的促癌特征。
5. 脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤中富集
髓系細(xì)胞是高度異質(zhì)性的免疫細(xì)胞群，對TME的形成起重要作用，因此在這一部分作者對髓系細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步分析。作者首先將GC TME中的髓系細(xì)胞聚類為8個(gè)不同的細(xì)胞簇，包括2個(gè)單核細(xì)胞簇、2個(gè)巨噬細(xì)胞簇和4個(gè)樹突狀細(xì)胞(DCs)簇(圖4a, b)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞簇Mφ_APOE共表達(dá)M1和M2巨噬細(xì)胞的特征(圖4c)。通過識(shí)別Mφ_APOE和Mφ_THBS1之間的DEGs，作者發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)相關(guān)基因(APOE, TREM2)和溶酶體基因(GRN, CD63, LAMP1)在Mφ_APOE中高表達(dá)，并且在腫瘤中特異性升高(圖4d, e)，表明脂質(zhì)相關(guān)和溶酶體功能是GC中巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)識(shí)(圖4c)。作者也發(fā)現(xiàn)MITF, NR1H3和TFEC在Mφ_APOE中特異性上調(diào)，并且這些調(diào)控因子也表現(xiàn)出與脂質(zhì)相關(guān)基因和溶酶體基因表達(dá)相似的模式(圖4f)。此外，作者發(fā)現(xiàn)與對照組相比TFEC及NR1H3過表達(dá)顯著上調(diào)了巨噬細(xì)胞中APOE和APOC1的表達(dá)(圖4g)。除了cDC1_XCR1、cDC2_CD1C和pDC_LILRA4三種傳統(tǒng)的DC細(xì)胞類型，作者還識(shí)別了一種非經(jīng)典的DC細(xì)胞類型DC_LAMP3，其特征是LAMP3和CCR7的特異性表達(dá)(圖4b)。作者基于RNA速率分析認(rèn)為LAMP3+DC可能來源于cDC2(圖4h)，且作者也發(fā)現(xiàn)雖然cDC2_CD1C細(xì)胞LAMP3和CCR7表達(dá)水平極低，但LAMP3和CCR7的未剪切RNA相對較高(圖4I)。
6. 大多數(shù)胃腫瘤的TME中都存在Tc17細(xì)胞
在這一部分作者對GC中T細(xì)胞的多樣性進(jìn)行了分析，首先提取了具有scRNA-seq數(shù)據(jù)和配對TCR信息的T細(xì)胞，并將其重新聚類為10個(gè)CD8+簇、6個(gè)CD4+簇、3個(gè)CD4+ Treg簇和1個(gè)代表T細(xì)胞當(dāng)前在細(xì)胞周期中進(jìn)展的循環(huán)簇(圖5a-c)。作者觀察到10例患者中，有8例CD8+ IL17+ T細(xì)胞占腫瘤浸潤T細(xì)胞總數(shù)的1%以上，且多色I(xiàn)HC染色也證實(shí)了胃癌TME中CD8+ IL17+ T細(xì)胞的存在(圖5d)。作者通過富集分析也發(fā)現(xiàn)CD8_C8_IL17A中上調(diào)的基因顯著富集于Th17細(xì)胞分化和炎癥性腸病(IBD)通路(圖5e)，這表明CD8_C8_IL17A和Th17細(xì)胞在胃癌TME中可能存在功能重疊。由于CD8_C8_IL17A細(xì)胞的這些特征與Tc17細(xì)胞相似，因此作者將這一簇細(xì)胞命名為Tc17。此外，作者也觀察到T細(xì)胞簇顯示出不同的組織分布模式(圖5b)。
7. Tc17和Th17細(xì)胞可能通過IL17/22/26信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的生長
這一部分作者試圖通過體外實(shí)驗(yàn)了解Tc17細(xì)胞在胃癌中的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從胃癌中分離的Tc17細(xì)胞可刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生CXCL12，進(jìn)而招募髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)，從而抑制細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞。此外，作者也發(fā)現(xiàn)多個(gè)Tc17細(xì)胞顯著上調(diào)基因能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，它們的受體也在腫瘤細(xì)胞中上調(diào)(圖5g)，且TCGA-STAD數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)這些受體在腫瘤組織中高表達(dá)(圖5h)。因此，作者假設(shè)在胃癌中IL17+ T細(xì)胞可以通過IL17, IL22和IL26信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長。
8. 用TCR分析解析T細(xì)胞亞型的狀態(tài)轉(zhuǎn)變
在這一部分作者試圖通過TCR克隆信息和偽時(shí)序分析來解析不同亞型T細(xì)胞之間的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換。作者觀察到T細(xì)胞中識(shí)別的36239個(gè)克隆型中，有30980個(gè)克隆型僅檢出1次(唯一TCR)， 5259個(gè)克隆型檢出2個(gè)或2個(gè)以上(非唯一TCR)，個(gè)體克隆群體大小從1到569(圖6a)。作者也觀察到除na?ve CD8+ T細(xì)胞(CD8_C1)外，CD8+ T細(xì)胞簇的克隆擴(kuò)張程度均高于CD4+ T細(xì)胞簇(圖6b)。研究也發(fā)現(xiàn)CD8_C2(效應(yīng)細(xì)胞)、CD8_C3(細(xì)胞毒性)、CD8_C4(效應(yīng)細(xì)胞記憶)和CD8_C10 (MAIT)簇的克隆細(xì)胞比例較高(圖6c)，且在高克隆簇中，CD8_C2多來源于血液，其標(biāo)記基因富集在細(xì)胞遷移相關(guān)通路中(圖6d)，因此作者推測CD8_C2具有從血液滲入組織的潛力。作者也發(fā)現(xiàn)相同克隆型的T細(xì)胞更有可能聚集在同一簇或密切相關(guān)的簇中(圖6e、f)。通過單細(xì)胞TCR測序數(shù)據(jù)作者根據(jù)每個(gè)T細(xì)胞簇內(nèi)的TCR基因使用情況將T細(xì)胞簇嵌入到一個(gè)3D空間(圖6g)，嵌入空間也表明CD8+ T細(xì)胞比CD4+T細(xì)胞顯示出更大的異質(zhì)性。接下來作者根據(jù)配對細(xì)胞簇共享的TCR克隆型的比例計(jì)算了克隆型共享矩陣，來評(píng)估它們譜系中的關(guān)系(圖6h)，結(jié)果觀察到與CD8+ T細(xì)胞相比，CD4+ T細(xì)胞的克隆型共享矩陣稀疏，因?yàn)镃D4+ T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增要低得多(圖6b)。作者根據(jù)克隆型共享矩陣(圖6h)以及血液和組織之間的共享比例(圖6c)的差異，假設(shè)了T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的兩種可能軌跡(圖6i)：一個(gè)軌跡為來源于CD8_C2(效應(yīng)細(xì)胞)的CD8_C3(細(xì)胞毒性)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D8_C4(效應(yīng)記憶)或CD8_C9(耗竭)細(xì)胞；另一個(gè)軌跡為來源于CD8_C5 (駐留)的CD8_C8 (Tc17)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD8_C9(耗竭)細(xì)胞。
9. 駐留CD8+ 通過Tc17參與T細(xì)胞耗竭軌跡
在這一部分作者對這些簇間的分化軌跡進(jìn)行了進(jìn)一步分析，首先在每個(gè)軌跡的簇中提取了共享相同克隆型的細(xì)胞，然后使用RNA速率分析來研究擴(kuò)散圖的方向性(圖6j, k)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來源血液的CD8+ T細(xì)胞通過CD8_C3(細(xì)胞毒性)細(xì)胞流向耗竭簇的強(qiáng)定向流(圖6j)。沿著這條耗竭軌跡，T細(xì)胞的殺傷分?jǐn)?shù)逐漸降低，耗竭分?jǐn)?shù)逐漸升高(圖6l, m)。且RNA速率顯示，組織駐留的CD8+ T細(xì)胞也通過Tc17細(xì)胞向耗竭群體定向流動(dòng)(圖6j)，表明組織駐留的CD8+ T細(xì)胞在TME中分化為Tc17細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生耗竭表型。因此，作者將T細(xì)胞耗竭的兩種軌跡命名為"細(xì)胞溶解耗竭軌跡"和" Tc17耗竭軌跡"。盡管最終都達(dá)到了耗竭狀態(tài)，但作者發(fā)現(xiàn)Tc17耗竭軌跡的耗竭評(píng)分與細(xì)胞溶解耗竭軌跡相比顯著升高(圖6)。此外，盡管經(jīng)歷了廣泛的克隆擴(kuò)增，Tc17在非na?ve CD8+ T細(xì)胞中的細(xì)胞溶解評(píng)分最低(圖6b)。總體而言，細(xì)胞溶解評(píng)分沿著細(xì)胞溶解耗竭軌跡降低，而沿著Tc17耗竭軌跡增加(圖6)。
10. 不同的轉(zhuǎn)錄程序與兩種耗竭軌跡相關(guān)
在這一部分，作者對上述這兩種耗竭軌跡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行了研究。作者推測Tc17細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞可以產(chǎn)生兩種不同類型的具有不同轉(zhuǎn)錄程序的耗竭T細(xì)胞，且差異基因分析也表明，Tc17來源的耗竭T細(xì)胞高表達(dá)KRT86，而細(xì)胞溶解來源的耗竭T細(xì)胞高表達(dá)GZMK(圖7a、b)。為了研究驅(qū)動(dòng)這兩個(gè)軌跡不同轉(zhuǎn)錄程序的潛在機(jī)制(圖7c)，作者重點(diǎn)分析了在這兩條軌跡中差異表達(dá)和激活的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的動(dòng)態(tài)變化，使用SCENIC識(shí)別沿兩種軌跡有差異激活的TF(圖7d)。通過SCENIC，結(jié)合偽時(shí)序和基因表達(dá)分析，作者發(fā)現(xiàn)與Tc17耗竭軌跡相比，EOMES及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)在細(xì)胞溶解耗竭軌跡中均較高(圖7c-f)。同樣，由于這些因子及其下游靶點(diǎn)的高表達(dá)，RUNX2被確定為Tc17耗竭軌跡中的潛在關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(圖7c-f)。綜上所述，作者識(shí)別了兩個(gè)衰竭過程中不同的調(diào)控程序，并確定了兩個(gè)過程的潛在關(guān)鍵調(diào)控因子。
11. 腫瘤相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞和髓細(xì)胞是復(fù)雜的細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)
在這一部分作者對參與胃癌的各種細(xì)胞類型之間復(fù)雜的通訊網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析。作者通過CellPhoneDB識(shí)別了腫瘤和正常組織中的細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)涉及TASCs和巨噬細(xì)胞的相互作用主導(dǎo)了TME網(wǎng)絡(luò)。作者觀察到Fib_1表達(dá)了大量腫瘤細(xì)胞的生長因子，Endo_1強(qiáng)激活TNF、VEGF、PDGF、PGF和Notch信號(hào)通路(圖8a, b)。通過進(jìn)行各細(xì)胞類型之間的相關(guān)性分析，作者也發(fā)現(xiàn)研究數(shù)據(jù)集和TCGA-STAD隊(duì)列中，TASC亞型的比例都是高度正相關(guān)的(圖8c)。此外，作者通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CAFs分泌的某些細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞進(jìn)入GC TME中的巨噬細(xì)胞狀態(tài)，上調(diào)Mφ_APOE和Mφ_THBS1標(biāo)記基因(圖8 d)，且Mφ_APOE評(píng)分呈持續(xù)上升趨勢，而Mφ_THBS1評(píng)分在誘導(dǎo)過程中呈現(xiàn)輕微變化(圖8e)。接下來，作者研究了TME中與淋巴細(xì)胞相關(guān)的顯著相互作用(圖8f)，并通過多色I(xiàn)HC染色證實(shí)了胃癌患者腫瘤切片上NECTIN2-TIGIT相互作用的存在(圖8f)。
到這里，這篇文章的主要內(nèi)容就結(jié)束了。文章構(gòu)建了一個(gè)全面的胃癌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，刻畫了免疫亞群，基質(zhì)亞群和上皮亞群的詳細(xì)和復(fù)雜的分類，并進(jìn)一步闡明了它們的分子特征和細(xì)胞間通訊，并識(shí)別出不同的T細(xì)胞耗竭軌跡。文章內(nèi)容豐富，邏輯嚴(yán)謹(jǐn)，對每個(gè)結(jié)果都從多個(gè)角度進(jìn)行了分析驗(yàn)證，無論是方法還是內(nèi)容都值得小伙伴們參考學(xué)習(xí)。
