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各位小伙伴大家好哇！今天小編給大家?guī)淼氖墙衲?月份剛剛發(fā)表在EBioMedicine (IF=11.205)上的一篇開發(fā)腫瘤預后signature的研究。最高端的研究往往采用最樸素的分析方式在這篇文章上提現(xiàn)的淋漓盡致，快來和小編一起看看吧！
一.研究背景
腫瘤是由嵌入在細胞外基質(zhì)、駐留間充質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和浸潤免疫細胞的微環(huán)境中的惡性細胞組成。腫瘤微環(huán)境的這些宿主元素支持或抑制腫瘤進展，并影響對抗癌治療的反應。
隨著免疫檢查點抑制劑(ICI)的引入，免疫微環(huán)境已經(jīng)成為癌癥研究的重點，它徹底改變了幾種癌癥的治療方法。目前ICI的反應預測生物標志物主要包括腫瘤細胞的特征，如PD-L1表達、錯配修復缺陷和腫瘤突變負擔(TMB)。然而，這些生物標志物的預測準確性較為一般。因此，迫切需要建立新的可靠的免疫生物標志物來預測免疫治療的預后和治療反應。本研究中，作者對結(jié)腸癌的免疫圖景進行了全面的概述，并解剖了腫瘤免疫微環(huán)境，特別關注促腫瘤免疫細胞亞類和那些對ICI抗性有潛在影響的細胞。確定了在結(jié)腸癌中具有最高預后價值的免疫細胞標志物，證明了該標志物在其他四種腫瘤類型中的預后能力以及其預測免疫治療反應的能力。
二.主要結(jié)果
1. 結(jié)腸癌中CD8+ T細胞和CD68+/CD163+巨噬細胞預后特征的鑒定
為了繪制免疫細胞圖譜，作者使用兩個抗體板對腫瘤組織中的適應性免疫細胞和先天免疫細胞進行了多重免疫熒光標記。這些標記的共表達模式允許免疫細胞被分類為不同的亞群(圖1a)。首先，作者將細胞密度評估為每個亞型在整個分析組織面積中的細胞數(shù)量，并使用三分位數(shù)作為截斷值對病例進行分類，從而將每種免疫細胞亞型的病例分為低、中、高密度；然后，作者評估了I-III期結(jié)腸癌中不同免疫細胞密度的預后影響，結(jié)果表明CD8+ T淋巴細胞和CD68+CD163+巨噬細胞(圖1b、c)與OS相關。
接下來作者假設CD8+ T淋巴細胞和CD68+CD163+巨噬細胞的相對浸潤水平捕獲了免疫微環(huán)境中抗腫瘤和促腫瘤方面的相互作用，通過計算CD8+細胞密度與CD8+和CD68+CD163+細胞密度之和的比值生成了一種組合免疫生物標志物，并將其稱為“免疫激活的特征”(SIA)(圖1f)。
2. SIA是結(jié)直腸癌和至少其他四種腫瘤類型的獨立預后生物標志物
這一部分作者為了確定SIA對OS和RFS的預后價值，以及最先進的免疫評分系統(tǒng)進行比較。通過量化腫瘤中心和浸潤邊緣的CD3+和CD8+細胞密度生成了免疫評分樣指標(IS)。結(jié)果表明，IS和SIA均與ⅰ~ⅲ期結(jié)腸癌患者的OS和RFS密切相關(圖2a、b)。AUC分析顯示T分期是當前OS的最強預測因子，N分期是RFS的最強預測因子(圖2c)。最后，在同一模型中整合臨床參數(shù)、IS和SIA, OS和RFS的中位AUC均有提高(圖2c)。SIA對OS預測的相對貢獻高于T期和N期，當將IS納入模型時，SIA和IS的相對貢獻超過50%，免疫細胞標志物超過臨床因素(圖2d)。
接下來，作者評估了SIA評分是否也適用于其他癌癥的預后。作者分析了多種癌癥患者SIA值與OS的關系，結(jié)果表明：在黑色素瘤、肺腺癌、膀胱尿路上皮癌和胃食管腺癌中，高SIA與較長的OS相關，而在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌和肺鱗狀細胞癌中無相關(圖3a) 當對同一腫瘤進行分析時，IS僅在肺癌(腺癌和鱗狀細胞癌)中具有預后意義，在子宮內(nèi)膜癌中僅有趨勢并無統(tǒng)計學顯著性(圖3b)。
此外，根據(jù)tAUC(time-dependent AUC)分析，SIA在預測上述癌癥的OS方面優(yōu)于IS(圖3c)。作者還發(fā)現(xiàn)腫瘤類型對免疫信號表現(xiàn)出不同的依賴性，據(jù)此確定了四種不同的癌癥類型(圖3d)：(a) SIA依賴/ IS未知的腫瘤(黑色素瘤、胃食管腺癌、膀胱尿路上皮癌); (b) SIA和IS依賴性腫瘤(結(jié)腸癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌); (c) SIA未知/ IS依賴的腫瘤(肺鱗狀細胞癌);(d) SIA和IS無關性腫瘤(卵巢癌)?？偨Y(jié)：腫瘤表現(xiàn)出不同于SIA和IS的依賴性，SIA在至少5種腫瘤類型中具有預后意義。
3. 影響預后的CD68+CD163+巨噬細胞產(chǎn)生補體復合物亞基C1Q
為了進一步定義CD68+CD163+細胞，作者分析了結(jié)腸癌、肺癌和葡萄膜黑色素瘤的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)。作者根據(jù)CD68和CD163的基因表達水平(即CD68+CD163+、CD68+CD163?和CD68?CD163+細胞)確定了三個巨噬細胞亞群，對這三個巨噬細胞亞群的差異表達基因的分析表明，CD68+CD163+亞群的細胞過表達C1QA、C1QB和C1QC，它們共同編碼C1補體復合體的一個亞成分C1q(圖4a-c)。通過分析三個單細胞數(shù)據(jù)集，作者觀察到C1QA、C1QB和C1QC幾乎只在巨噬細胞中表達；在分析巨噬細胞亞類時，C1QA-C表達在CD68+CD163+巨噬細胞中是特異性的，在CD68+CD163?細胞中表達非常低(圖 4d)。
作者認為，由于C1QA-C在癌癥中的表達主要在CD68+CD163+巨噬細胞中檢測到，因此在bulk RNA水平分析的補體C1q成分的合成可以用于估計腫瘤CD68+CD163+樣巨噬細胞的數(shù)量。接下來作者通過計算CD8A表達水平與C1QA、C1QB或C1QC的比值對患者樣本進行二分，并對多種癌癥進行生存分析。結(jié)果表明除肺鱗狀細胞癌和卵巢癌外，高比值的患者生存率較好(圖4e)，總的來說，CD8與C1Q基因表達的比值與多種腫瘤類型的預后有關。
4. SIA預測免疫治療的反應
在這一部分，作者對SIA是否可以預測ICI治療的應答進行研究。作者分析了接受抗pd -1治療的黑色素瘤患者的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，計算CD8A與C1QA、C1QB或C1QC基因表達的比值。結(jié)果顯示，完全響應組的SIA值高于部分響應組和無響應組(圖5a)。
為了更準確地評估signature，作者接下來分析了接受抗PD-1和/或抗CTLA-4治療的黑色素瘤患者的單細胞測序數(shù)據(jù)。結(jié)果表明通過CD8A與CD68+CD163+、CD68+C1QA+、CD68+C1QB+或CD68+C1QC+計算的SIA值中，高SIA評分均和免疫檢查點抑制劑療效顯著相關(圖 5b)。
接下來，作者還分析了4例接受了ICI治療腎細胞癌患者的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)。考慮到CD68+CD163+巨噬細胞的補體共表達，與一名腫瘤進展患者相比，兩名部分緩解患者的SIA較高(圖5C)。綜上，這些結(jié)果表明，SIA可以預測黑色素瘤和潛在的其他腫瘤類型對ICI治療的反應。
至此，這篇文章就介紹完啦，是不是感覺簡潔但又不失深度?？偨Y(jié)一下：作者從實驗出發(fā)，通過免疫組化標記所計算的免疫細胞密度，發(fā)現(xiàn)CD8+ T淋巴細胞和CD68+CD163+巨噬細胞與結(jié)腸癌患者OS相關，并且計算CD8+細胞密度與CD8+和CD68+CD163+細胞密度之和的比值為SIA值；第二步在多個癌癥中探討SIA值的預后效能；第三步通過單細胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)C1Q基因可以在bulk數(shù)據(jù)中評估腫瘤CD68+CD163+樣巨噬細胞的數(shù)量，于是簡化SIA值為CD8A的表達與C1QA表達的比值；最后通過分析免疫治療的單細胞數(shù)據(jù)驗證了SIA具有可以預測ICI治療反應的潛力。以往我們看到的文章大部分都是生信提出signature實驗進行驗證，這篇文章最大的亮點莫過于從實驗出發(fā)定義signature，通過生信分析驗證，讓審稿人眼前一亮。全篇的生信分析也無非生存分析以及單細胞的基礎分析，這個思路快快學起來！
