總結各種細胞外小泡（EV）研究思路

癌細胞與宿主微環(huán)境中其他細胞相互作用，操縱周圍間質，為癌細胞的成長和免疫逃逸提供條件。細胞間的通訊傳統(tǒng)上集中在趨化因子、細胞因子、炎癥介質和生長因子上，但涉及細胞外小泡(EV)的新興通路正受到越來越多的關注。免疫抑制的TME在一定程度上是由大量的腫瘤相關巨噬細胞(TMA)產生和維持的。TMA可以極化成M1或M2樣的巨噬細胞。EVs是一種高效的細胞間通訊分子，被彈射到TMA極化的中心。今天小編給大家?guī)硪黄P于EV的綜述，詳細研究了EVs在維持腫瘤微環(huán)境（TME）中的決定性作用。

背景

EVs是幾乎所有類型細胞分泌的組織特異性膜性囊泡。EVs作為細胞間通訊的中介物質，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮多種功能，包括促進腫瘤侵襲轉移、促進免疫逃逸、誘導腫瘤前環(huán)境等。腫瘤細胞分泌的EV是正常細胞的10倍，EV的減少通常與抑制腫瘤生長有關。低氧條件下EV分泌增加的各種機制包括釋放低氧誘導因子(HIF)、神經酰胺、Rab蛋白家族和NF-κB。基于不同的分子特征和組成，EV可以通過傳遞miRNAs刺激TAMs從M1樣表型轉變?yōu)镸2樣表型，反之亦然。雖然大多數(shù)研究都集中在miRNAs通過EVS的轉運，但也有少數(shù)研究探索了circRNAs和lncRNAs的作用。因此，文章圍繞非編碼RNA，特別是miRNAs、circRNAs和lncRNAs在腫瘤相關巨噬細胞極化中的功能作用展開。

在腫瘤中，巨噬細胞同時具有促腫瘤和抗腫瘤的能力。TAMs具有高度多樣化的功能，一般可分為抗腫瘤M1表型或親腫瘤M2表型。抑制腫瘤的M1樣TAMs可以誘導腫瘤細胞死亡，并破壞周圍環(huán)境。在炎癥反應具有自限性的正常情況下，M2巨噬細胞可以清除死亡細胞，促進組織修復和抑制炎癥。但腫瘤細胞可以利用M2巨噬細胞形成免疫抑制環(huán)境。巨噬細胞的極化是動態(tài)的，可以在炎癥過程中任何時間發(fā)生，這特別取決于消退炎癥所需的時間。有三個相互關聯(lián)的途徑控制著巨噬細胞的極化：組織微環(huán)境、內在的表觀遺傳調節(jié)以及外部因素，如微生物和病原體。

轉錄圖譜研究表明，巨噬細胞分化與DNA甲基化、核小體結構和組蛋白修飾有關。例如，miR-127和miR-155已被證明抑制BCL6并促進M1極化。miR-155可下調IL-13RA1和SOCS1，這可以導致M2表型激活。其他關鍵的調控途徑通常涉及NF-κB、PPAR-δ、cMyC、STAT、SOCS和HIF家族基因。M1/M2 TAM的偏振態(tài)也與空間和時間有關。例如，在腫瘤發(fā)展的初始階段，通過激活NF-κB而增加M1極化對于控制進展至關重要。然而，在腫瘤發(fā)生的晚期，NF-κB被抑制，巨噬細胞被轉換為免疫抑制。

同樣，EVs的時空分泌也受到癌癥進展程度的影響。在多種類型的癌癥中，腫瘤細胞通過EVs觸發(fā)巨噬細胞極化。有必要研究EVs如何觸發(fā)TAMS從炎癥表型向免疫抑制表型的轉變。

腫瘤細胞來源的EVs對巨噬細胞極化的影響

目前的研究表明，來自癌細胞的EV miRNAs可以靶向多種信號通路，包括涉及SOCS3/4/STAT3，PTEN/PI3K/AKT/STAT3/6，PTEN等信號通路（圖1）。目前的研究集中在研究與STAT3/6和PI3K/AKT相關的通路。

1. STAT3/6 pathway

生物學上，STAT蛋白在細胞增殖、細胞凋亡和免疫調節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用。STAT表達異常與多種人類癌癥有關。STAT3參與腫瘤的生長和免疫逃逸，促進免疫抑制的TME，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用。STAT活性主要由JAK/STAT途徑激活。作為JAK的抑制劑，SOCS蛋白可以直接結合并失活其激酶活性。激活的STAT刺激SOCS的轉錄，這可能導致JAK-STAT途徑的抑制，產生一個經典的反饋回路。

Ying等人證明了巨噬細胞能夠攝取癌癥來源的EV，并且miR-222-3p誘導的SOCS3下調和STAT3上調可能是巨噬細胞獲得腫瘤相關表型的重要途徑。同樣，在卵巢癌中，來自EOC細胞的EVs可以誘導巨噬細胞的表型極化為促進腫瘤的M2型。在低氧條件下，含有高水平miR-21-3p、miR-125b-5p和miR-181D-5p的EV可被巨噬細胞吞噬。Xin等人發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p下調SOCS4/5、miR-21-3p和miR-181D-5p，從而促進STAT3磷酸化并誘導M2極化。這三種miRNAs在卵巢癌鼠體內的過表達導致M2極化，促進癌細胞的增殖和遷移。綜上所述，EOC細胞來源的EV攜帶的三個miRNAs可能通過調節(jié)SOCS4/5/STAT3通路促進巨噬細胞向促腫瘤表型的極化。

除了在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)EVs通過激活STAT3促進巨噬細胞極化外，Chen等還發(fā)現(xiàn)LUAD細胞來源的EVs可以通過傳遞miR-19b-3p來調節(jié)PTPRD/STAT3通路，導致M2極化。他們發(fā)現(xiàn)，通過miR-19b-3p抑制PTPRD可促進STAT3的磷酸化，導致LUAD細胞M2極化和轉移。

在結直腸癌(CRC)中，miR-203作為一種信號分子在腫瘤細胞和單核細胞之間進行通訊。含有高水平miR-203的CRC細胞來源的EV可以促進單核細胞極化為M2型巨噬細胞，并刺激癌細胞轉移。使用CRC和THP-1細胞，作者發(fā)現(xiàn)miR-203上調CD163和STAT3的表達水平，從而導致M2極化。同時，作者推測miR-203可能也在這個過程中下調了SOCS3的表達。

miR-29a-3p在來自口腔鱗癌組織的EV中上調，并可能觸發(fā)巨噬細胞極化。來自SCC-9和CAL-27細胞的EV與巨噬細胞共同培養(yǎng)，導致miR-29a-3p表達增加，SOCS1表達降低，導致p-STAT6表達增加，M2極化。此外，miR-29a-3p還促進口腔鱗癌細胞的遷移和侵襲。

癌細胞EVS中包裹的circRNAs和lncRNAs也被發(fā)現(xiàn)針對涉及STAT3/STAT6的通路。在腎癌中，Huang等人發(fā)現(xiàn)CircSAFB2在腎癌組織和腎癌來源的EVs中高表達。使用769-P和ACHN細胞株的研究表明，含有高水平circSAFB2的腎癌來源的EV促進巨噬細胞M2極化。具體來說，circSAFB2可以作為miR-620的海綿，間接促進JAK1和STAT3的蛋白表達。JAK1作為STAT3的上游調節(jié)因子，是M2極化的重要調控因子。在腎癌中，Zhang等報道了腫瘤來源的EV含有高水平的IncARSR，它直接與miR-34/miR-449相互作用，促進STAT3的表達，促進巨噬細胞極化。

在非小細胞肺癌中，LINC00313在H1299來源的EVs中高表達。LINC00313是miR-135a-3p的海綿，促進STAT6表達和巨噬細胞M2極化。在小鼠-異種移植模型中，研究發(fā)現(xiàn)LINC00313的過表達促進了腫瘤的進展和M2巨噬細胞標志物水平的增加。

2. PI3K/AKT pathway

PI3K/AKT是對細胞基本功能有廣泛影響的細胞內信號通路之一。PI3K/AKT通常與哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)一起調節(jié)細胞的增殖、生長和凋亡，縮短細胞周期，促進血管生成，被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展中最重要的靶點之一。PIP3可以與質膜上的PKB/AKT結合。AKT可以磷酸化細胞增殖、凋亡和代謝的各種底物，參與血管生成和細胞遷移，促進腫瘤的發(fā)生。作為PI3K/AKT的下游靶點，mTOR可以調節(jié)腫瘤生存所需的各種蛋白質，促進腫瘤的發(fā)生。值得注意的是，腫瘤抑制蛋白張力蛋白同源物(PTEN)可以通過PIP3的去磷酸化來逆轉AKT的激活，從而對PI3K誘導的信號轉導起負調控作用。PTEN的失活會導致細胞的異常生長、存活和增殖。

PI3K/AKT是促進巨噬細胞M2極化的主要途徑之一。結直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4信號通路誘導肝轉移。在CXCR4^+/?Apc^Min/+復合突變小鼠中，CXCR4的激活與TAMS的增加呈正相關。隨后，研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4過表達上調了HCT116來源的EV中miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p的水平。在這三種miRNAs的作用下，巨噬細胞中PTEN的表達顯著降低，p-AKT顯著增加，提示miRNAs可能通過抑制PTEN的表達，促進M2巨噬細胞的極化，促進血管生成和遷移，從而激活PI3K/ATK通路。有研究人員發(fā)現(xiàn)miR-934水平異常升高。在hnRNPA2B1的幫助下，MiR-934被包裝到CRC細胞的EVs中，并轉移到巨噬細胞，通過降低PTEN的表達而導致PI3K/AKT的激活，使巨噬細胞向M2表型極化。

來自上皮-間充質轉化(EMT)結直腸癌細胞的EVs被巨噬細胞攝取，導致巨噬細胞表型重塑。楊等人的研究確定miR-106b-5p是介導這一過程的關鍵EV miRNA。此外，結直腸癌患者的miR-106b水平也較高，而抑癌蛋白PDCD4的水平較低。作者認為miR-106b-5p可能通過抑制PDCD4和激活PI3K/AKT/mTOR通路，在體內誘導巨噬細胞M2極化，促進結直腸癌的進展。

在膀胱癌細胞中，Lin等人在T24細胞來源的EVs中發(fā)現(xiàn)了高水平的miR-21，miR-21靶向PTEN通過PI3K/AKT/STAT3途徑誘導巨噬細胞極化。在此基礎上，Jiang等人發(fā)現(xiàn)，MB49膀胱癌細胞來源的EVs下調巨噬細胞PTEN的表達水平，并通過PTEN/AKT/STAT3/6通路促進巨噬細胞極化為M2表型。Jiang等人證明了miR-92b-3p和miR-1231-5p可能通過下調PTEN和激活AKT/STAT3/6通路而誘導巨噬細胞M2極化，從而促進腫瘤的發(fā)展。

在低氧條件下，腫瘤細胞被刺激以更快的速度分泌EVs。這些EV富含免疫抑制因子，可能在促進腫瘤進展方面發(fā)揮重要作用。Wang等人發(fā)現(xiàn)富含miR-301a-3p的胰腺癌細胞來源的EVs可以靶向巨噬細胞表達PTEN，誘導PI3K-γ、p-AKT和p-MTOR的表達增加，并促進巨噬細胞在缺氧環(huán)境中極化為M2表型。研究表明，分化為M2表型的巨噬細胞可以促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲

除了miRNAs，研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以通過EVs運輸circRNAs和lncRNAs，以靶向PI3K/AKT信號通路。Hang等人發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清和組織中均存在circFARSA的高表達。進一步發(fā)現(xiàn)circFARSA可以促進PTEN的降解，激活PI3K/AKT通路，并將巨噬細胞極化為M2表型，從而促進NSCLC的進展。在肺腺癌中，含有l(wèi)ncSNHG7的腫瘤來源的EV促進了LUAD細胞中與自噬相關的多西紫杉醇抵抗以及M2極化。

腫瘤相關巨噬細胞衍生的EVs在腫瘤調控中的作用

腫瘤細胞可以通過EVs修飾巨噬細胞，并將其極化為有利于促進腫瘤發(fā)展的表型。反過來，巨噬細胞也可以分泌EVs來調節(jié)腫瘤的狀態(tài)、發(fā)生和發(fā)展（圖3）。在這一部分中，作者討論了一些由巨噬細胞來源的EV分泌的關鍵miRNAs，circRNAs和lncRNAs在促進癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用。

MicroRNAs

1. miR-21

目前大多數(shù)涉及腫瘤細胞來源的EV的研究都集中在巨噬細胞極化過程中miRNAs的運輸。其中miR-21、miR-155和miR-223已被重復鑒定(圖4)。來源于M2巨噬細胞的EV miR-21介導M2巨噬細胞與胃癌細胞之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞與表達M2巨噬細胞來源的EVS的miR-21共培養(yǎng)顯示出更高的耐藥性。有趣的是，腫瘤細胞分泌的miR-21可以通過PTEN/PI3K/AKT/STAT3途徑誘導巨噬細胞M2極化。這些結果表明，腫瘤細胞來源的miR-21和巨噬細胞來源的miR-21都可以作用于相同的信號通路來誘導腫瘤的發(fā)生，盡管事件的順序尚不清楚。

M2巨噬細胞來源的miR-21不僅對胃癌細胞有促進作用，在膠質瘤細胞中也有類似的結果。Yang等人發(fā)現(xiàn)高表達miR-21的M2巨噬細胞來源的EV與PEG3的下調和膠質瘤細胞的腫瘤免疫逃逸有關。

除了影響腫瘤細胞外，miR-21還直接作用于腫瘤干細胞。Chang等人發(fā)現(xiàn)來源于M2巨噬細胞的miR-21a-5p可以通過EV轉運被胰腺癌干細胞吸收，并進一步促進干細胞的分化能力和活性。

TAMs來源EVs的miR-21影響上皮性卵巢癌（EOC）中調節(jié)性Treg/Th17細胞的比率和STAT3的表達。miR-21-5p直接靶向STAT3來改變T細胞的極化方向。這導致Treg細胞比例增加，Th17細胞比例下降，從而形成了免疫抑制的微環(huán)境，有利于EOC的發(fā)展和遷移。

EVs運載的貨物種類繁多，巨噬細胞來源的EVs可以同時運輸多種功能的miRNA。Lan等人發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細胞來源的EV富含miR-21-5p和miR-155-5p。它們協(xié)同作用促進結直腸癌的惡性轉移。特別是miR-21-5p和miR-155-5p都可以靶向和抑制BRG1的表達，BRG1與結直腸癌細胞的遷移、侵襲和轉移密切相關。

2. MiR-155

M2巨噬細胞的EV也在各種類型的癌癥中運輸miR-155。腎細胞癌的惡性發(fā)展與TAMs的侵襲密切相關。miR-155-5p通過TAMs來源的EVs被整合到腎癌細胞中。隨后，miR-155-5p人類抗原R(HuR)結合上調IGF1R信號，激活PI3K/AKT通路。這些結果表明，無論是來自腫瘤細胞來源的還是來自巨噬細胞來源的EV的多個miRNAs都可以靶向PI3K/AKT，從而誘導腫瘤細胞的惡性進展。

miR-155-5p在M2巨噬細胞來源的EVs和結腸癌細胞中高表達，并能促進結腸癌細胞的增殖和免疫逃逸。M2巨噬細胞來源的EV miR-155-5p抑制ZC3H12B基因的表達，導致IL-6表達上調，從而促進結直腸癌的免疫抑制環(huán)境和進展。顱內動脈瘤(IA)的微環(huán)境中，TAMs來源的EV也大量表達miR-155-5p。利用平滑肌細胞(SMC)發(fā)現(xiàn)miR-155-5P可以加速SMC的遷移和增殖過程，而GREM1是響應這一過程的關鍵因素。抑制GREM1可能是促進IA形成和發(fā)展的可能機制。

其他研究也報道了miR-155與肺癌轉移和預后不良的關系。非小細胞肺癌組織中存在高水平的M2、TAMs和miR-155。M2巨噬細胞來源的EV運輸miR-155并抑制RASSF4的表達，導致癌細胞存活和遷移。miR-155不僅促進了NSCLC細胞的存活，而且通過靶向RASSF4促進了NSCLC的體內轉移。TAMs衍生的EV可以將miR-155轉運到成神經細胞瘤（NBL）細胞中，并增強耐藥性。TERF1作為miR-155的靶基因，在這一過程中發(fā)揮著重要作用。有趣的是，miR-155的表達上調是由NBL來源的EV miR-21介導的，兩種miRNAs的表達水平呈正相關。

3. miR-223

巨噬細胞來源的EV miR-223在多種癌癥中發(fā)揮重要的促癌作用。Gao等人發(fā)現(xiàn)，M2樣TAMs在胃癌組織中豐富，并分泌大量含有miR-223的EV，從而促進GC對阿霉素的耐藥性。在乳腺癌中，miR-223可以與MEF2C基因結合，上調β-catenin的表達，促進乳腺癌細胞的惡性發(fā)展。miR-223在EOC中誘導耐藥。miR-233誘導EOC細胞耐藥是通過抑制PTEN和激活PI3K/AKT通路實現(xiàn)的。巨噬細胞來源的EV miR-21和miR-155也被發(fā)現(xiàn)通過激活PI3K/AKT通路促進腫瘤細胞的惡性表型。這些結果證實了PI3K/AKT通路在腫瘤細胞與巨噬細胞相互作用中的重要性。

4. Circular RNAs

最近的研究也強調了cirRNAs在巨噬細胞激活中的作用。子宮內膜癌(EC)中富集的M2樣TAMs可以通過釋放EV而下調EC的放射敏感性。Chen等人報道，由腫瘤相關M2巨噬細胞分泌的circ0020256促進膽管癌細胞(CCA)的遷移、增殖和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)circ0020256的過表達能夠降低miR-432-5p，從而間接上調其下游靶標E2F3的mRNA表達。這些結果表明M2巨噬細胞的EVs可能通過circ0020256/miR-4325p/E2F3軸促進CCA進展。

5. Long non-coding RNAs

Mi等人發(fā)現(xiàn)M2巨噬細胞來源的EV可以作為載體將lncAFAP1-AS1轉移到EC細胞。miR-26a是一種腫瘤抑制因子，通過抑制ATF2的表達而在許多癌癥中發(fā)揮作用。在EC細胞中，lncAFAP1-AS1通過與miR-26a結合上調ATF2的表達，從而增強EC細胞的遷移能力。同樣，在PANC-1細胞中，M2巨噬細胞來源的EVs中l(wèi)ncSBF2-AS1的上調促進了腫瘤細胞的增殖和遷移。

此外，巨噬細胞中高水平的lncLIFR-AS1可以通過EVs傳遞到骨肉瘤細胞，從而促進骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展。巨噬細胞來源的EV中高表達的lncLIFR-AS1通過調節(jié)miR-29a/NFIA軸促進骨肉瘤。

在胃癌中，富含lncCRNDE的TAMs EV可以轉移到GC細胞增強PTEN泛素化。在M2巨噬細胞分泌的EVs中沉默CRNDE促進了GC細胞對順鉑的敏感性。另一項研究發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細胞來源的EV AGAP2-AS1通過降低miR-296和上調NOTCH2來促進肺癌對放射治療的免疫。巨噬細胞來源EV的LncRNAs也被發(fā)現(xiàn)調節(jié)肝細胞癌的糖酵解途徑。值得注意的是，含有高水平lncMMPA的TAMs EV促進了肝癌細胞的增殖和有氧糖酵解。此外，lncMMPA還可以作為miR-548海綿，間接上調ALDH1A3的mRNA水平，這對促進細胞增殖和糖代謝具有重要意義。

總結

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)展和轉移中起著至關重要的作用，對腫瘤的治療耐藥性提出了巨大的挑戰(zhàn)。從腫瘤細胞分泌和傳遞EV來極化腫瘤相關的巨噬細胞是維持免疫抑制微環(huán)境的一種有效而復雜的方法。

此外，被腫瘤EVs極化的巨噬細胞隨后可以釋放EVs，以進一步維持TME并促進腫瘤細胞的生長。巨噬細胞不僅被重塑來促進TME中的免疫逃逸，而且被轉化為癌癥傳播工具，以釋放促進腫瘤的EV。目前，腫瘤相關EVS的主要焦點仍然是非編碼RNA的傳遞。此外，雖然大多數(shù)研究都報道了EVs的促腫瘤作用，但很少有人強調EVs的腫瘤抑制功能。EVs作為細胞間通訊的有效介體，其功能及其調節(jié)機制是多方面的。作為癌癥治療的一種形式，有必要進一步研究修飾EVs以逆轉腫瘤相關巨噬細胞極化的方向，并創(chuàng)造一個腫瘤抑制微環(huán)境。