掃碼聯(lián)系客服
癌前病變出現(xiàn)在癌癥發(fā)生之前且有助于癌癥的發(fā)生，因此了解癌前及癌變階段的異常表型對于探索癌癥發(fā)生的分子機制并開發(fā)早期診斷及預(yù)防策略至關(guān)重要。今天小編給大家分享一篇今年3月剛剛發(fā)表在Cell Discovery(IF:30.079)雜志上使用單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)解析口腔鱗狀細(xì)胞癌早期及癌前病變的文章。
Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma
口腔鱗狀細(xì)胞癌起始過程中癌前病變的單細(xì)胞和空間解析
一．研究背景
口腔黏膜癌前病變是口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)發(fā)生的重要因素。然而，目前關(guān)于癌癥起始階段的細(xì)胞組成和空間組織是如何促進(jìn)人類OSCC發(fā)生的仍不清楚。因此小編今天介紹的文章就對OSCC癌前病變及起始階段的細(xì)胞形態(tài)和作用進(jìn)行了刻畫，這對理解整個OSCC發(fā)生過程至關(guān)重要，并有助于制定癌癥治療策略。
二．文章摘要
研究分析了來自9個樣本的極早期OSCC、癌前病變，以及匹配的正?？谇火つそM織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄(scRNA-seq)及空間轉(zhuǎn)錄(ST)數(shù)據(jù)。結(jié)果研究識別出了有利于OSCC發(fā)生的異常上皮基因表達(dá)。研究也發(fā)現(xiàn)不同的成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群都會參與微環(huán)境的重塑。此外，研究在癌前病變周圍觀察到一種獨特的免疫抑制性單核細(xì)胞亞群和VEGF信號通路的空間轉(zhuǎn)換調(diào)控會共同促進(jìn)癌癥發(fā)生。
三．文章的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 早期OSCC腫瘤、口腔白斑和正常區(qū)域活檢樣本的scRNA-seq和ST分析
研究首先對不同區(qū)域樣本的scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了介紹。研究收集了9個人的早期OSCC (T)、口腔白斑(DN)及正常區(qū)域(N)的10個組織樣本并進(jìn)行了scRNA-seq分析和ST分析(圖1a、b)。此外，研究分析了蘇木精-伊紅染色(H&E)并由專家標(biāo)記組織學(xué)區(qū)域的圖像數(shù)據(jù)(圖1c)。經(jīng)過質(zhì)控后，RNA-seq共分析了52721個細(xì)胞，其平均測序深度為43905個讀數(shù)(reads;圖1d-f)。接下來研究在表達(dá)標(biāo)化和主成分分析(PCA)后，將這些細(xì)胞聚類成11個亞群，并根據(jù)標(biāo)記基因?qū)@些亞群進(jìn)行了注釋(圖1d-f)，其中包括口腔上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B/漿細(xì)胞、髓系細(xì)胞、T細(xì)胞、肌細(xì)胞等(圖1d，e)。此外，研究在ST分析中對26773個斑點(spot)進(jìn)行了測序，且對N、DN、T和薄層區(qū)域的ST數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞類型標(biāo)記評分，并在熱圖中展示了細(xì)胞類型的占據(jù)和富集情況(圖1g)。研究觀察到ST數(shù)據(jù)中排名最高的是上皮細(xì)胞，其次是成纖維細(xì)胞，髓系細(xì)胞和T細(xì)胞(圖1g)，進(jìn)一步研究也在P1樣本中展示了特定細(xì)胞類型標(biāo)志物的代表性表達(dá)特征(圖1h)。
2. 上皮細(xì)胞的高拷貝數(shù)變異(CNV)、FRA和mTORC1信號評分與OSCC發(fā)生的相關(guān)性
這一部分研究對上皮細(xì)胞與OSCC發(fā)生的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析。研究首先對上皮細(xì)胞進(jìn)行了重聚類，分為C1和C2兩部分(圖2a)，其中大多數(shù)亞群位于C1，一小部分亞群分散分布于C2，且C2中的大部分細(xì)胞來自T區(qū)域(圖2a)。接下來為了區(qū)分惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞，研究對上皮細(xì)胞進(jìn)行了拷貝數(shù)變異（CNVs）推斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DN和T區(qū)域的上皮細(xì)胞中CNV逐漸富集(圖2b)。接下來研究在ST中觀察到DN和T區(qū)域富集糖酵解、缺氧和DNA錯配修復(fù)等經(jīng)典癌癥通路和標(biāo)志物(圖2c)。此外，研究也在scRNA-seq中觀察到EMT、mTORC1、FRA通路在OSCC發(fā)生過程中(從N、DN到T組)逐漸富集(圖2d)，ST數(shù)據(jù)也揭示了FRA和mTORC1通路相似的變化趨勢(圖2e, c)。研究也通過細(xì)胞互作分析發(fā)現(xiàn)在N階段基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間很少有相互作用。然而，從DN期到T期，上皮細(xì)胞和周圍基質(zhì)細(xì)胞之間頻繁的交互，表明DN期上皮細(xì)胞的表達(dá)和相互作用發(fā)生了巨大的變化(圖2f)。
3. 識別參與調(diào)控OSCC起始過程的起始相關(guān)上皮標(biāo)志物
這一部分研究對參與OSCC起始的上皮細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行了介紹。研究首先識別了在OSCC起始過程中上皮細(xì)胞中逐漸上調(diào)的基因，并將其稱為“起始相關(guān)”基因(圖2g)，結(jié)果在scRNA-seq數(shù)據(jù)中識別了8個起始相關(guān)基因，同時研究使用ST數(shù)據(jù)對這些基因進(jìn)行了確認(rèn)，這8個基因分別為CTSC、FADD、ITGB4、LGALS1、LY6K、PMEPA1、TFAP2A和TGFβI(圖2h, i)。接著研究通過ST特征圖和組織學(xué)染色證實TFAP2A在上皮細(xì)胞中的表達(dá)隨著OSCC的發(fā)生而逐漸增加(圖2j, k)。進(jìn)一步研究在體外類器官中敲低TFAP2A后，發(fā)現(xiàn)增殖速度減慢，其他啟動相關(guān)基因的表達(dá)也降低(圖2l, m)。
4. Mesen_CAF亞群主導(dǎo)OSCC的起始并且在空間上更接近上皮細(xì)胞
這一部分研究對成纖維細(xì)胞進(jìn)行了分析。研究首先將成纖維細(xì)胞分為三個亞群:Mesen_CAF、Infla_CAF和cycling_CAF(圖3a)。結(jié)果觀察到Mesen_CAF亞群細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)基因(ASPN、POSTN和TNC)和促進(jìn)間充質(zhì)的TF (TWIST2)高表達(dá)(圖3b)，且同時富集非經(jīng)典WNT通路(APCDD1, PMEPA1和WNT5A)和趨化因子標(biāo)志物(CCL2和IL1R1)(圖3b)。而Infla_CAF亞群富集經(jīng)典基質(zhì)細(xì)胞衍生因子CXCL12，并高表達(dá)激素和代謝相關(guān)標(biāo)志物(IGF1和CFD)(圖3b)。Cycling_CAF則為較小的群體，富集于細(xì)胞增殖相關(guān)的MKI67、CDK1和UBE2C基因。研究也觀察到這些亞群都表達(dá)經(jīng)典的CAF標(biāo)記物(圖3c, d)。ST和標(biāo)記染色數(shù)據(jù)分析也發(fā)向在OSCC起始期間，Mesen_CAF標(biāo)記物表達(dá)呈逐漸增加的趨勢(圖3e-g)，并廣泛分布于上皮區(qū)域，這表明Mesen_CAF可能參與上皮細(xì)胞癌變過程(圖3e、f)。研究進(jìn)一步對這兩個成纖維細(xì)胞亞群的富集分析也發(fā)向Mesen_CAF富集于TGFβ， EMT，血管生成和PI3K-AKT-mTOR通路，這些通路之前已經(jīng)被報道對癌癥的發(fā)展至關(guān)重要，這意味著其在OSCC發(fā)生的微環(huán)境塑造中具有潛在的作用(圖3h)。
5. Mono_INHBA亞群在DN期頻繁與CAFs、耗竭T細(xì)胞和上皮細(xì)胞相互作用
這一部分研究對腫瘤的免疫微環(huán)境進(jìn)行了分析。研究首先使用ST數(shù)據(jù)分析了免疫細(xì)胞的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LYZ(髓系細(xì)胞標(biāo)記)和CD14(單核細(xì)胞標(biāo)記)富集在全組織切片或切片的DN和T區(qū)域(圖4a, b)。在髓系細(xì)胞亞群，研究觀察到DC細(xì)胞表現(xiàn)出HLA-DRs+和CD14-特征(圖4c)，單核細(xì)胞高表達(dá)CD68和CD14(圖4c)。其中Mono_INHBA和Mono_NLRP3為經(jīng)典的CD14+ CD16 -單核細(xì)胞，并高表達(dá)單核細(xì)胞標(biāo)志物S100A8、S100A9和VCAN(圖4d)。作者根據(jù)CD16、CD163和MRC1識別了巨噬細(xì)胞，并根據(jù)特異標(biāo)志物將巨噬細(xì)胞分為Macro_SELENOP、Macro_APOE和Macro_NRG1三個亞群。scRNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)DN區(qū)域中Mono_INHBA亞群的平均比例最高，不過有兩個個體的Mono_INHBA總體較低(圖4e)。研究也通過多重免疫組織化學(xué)(mIHC)染色進(jìn)一步驗證了Mono_INHBA的富集在DN階段(圖4f)。研究也觀察到Mono_INHBA富集到M2樣免疫抑制和血管生成活性(圖4g)。此外，研究發(fā)現(xiàn)Mono_INHBA在空間上更接近耗竭的CD8+ T細(xì)胞(CD8+ Tex)，并且它們通過CSF1-CSF1R相互作用(圖4h)，且Mono_INHBA也通過CD274-PDCD1和PVR/ NECTIN2-TIGIT與CD8+ Tex相互作用，促進(jìn)DN區(qū)域的免疫耐受(圖4g, i)，Mono_INHBA也與CAFs通信，從而調(diào)節(jié)其膠原形成和其他間質(zhì)活性(圖4j)。進(jìn)一步研究通過在口腔白斑類器官中添加THBS1來模擬相互作用，觀察到THBS1會促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和起始相關(guān)基因的表達(dá)(圖4k, l)。
6. Cluster 2-Mesen_CAF、Macro_APOE/NRG1和TNFRSF4+ Treg亞群參與DN向T分期的轉(zhuǎn)變
這一部分研究對觸發(fā)OSCC發(fā)病過程及構(gòu)成因素進(jìn)行了探索。研究首先觀察到從DN到T每個個體中Mesen_CAF Cluster 2都在T區(qū)域明顯增加(圖5a)，該亞群中間充質(zhì)祖細(xì)胞和基質(zhì)活化標(biāo)志物高表達(dá)(圖5b)，在ST數(shù)據(jù)中也一致(圖5c)。此外，研究也發(fā)現(xiàn)在每個個體中，從DN到T階段，Macro_NRG1和Macro_APOE的比例增加，在ST數(shù)據(jù)中也觀察到類似的趨勢(圖5d, e)。研究在scRNA-seq數(shù)據(jù)中也發(fā)向Macro_NRG1和Macro_APOE富集到ROS和血管生成通路(圖4g)。ST數(shù)據(jù)分析則發(fā)現(xiàn)M2樣巨噬細(xì)胞和血管生成通路從DN到T分期呈增加趨勢(圖5e)。此外，研究也發(fā)向這兩種亞型的細(xì)胞比例與上皮細(xì)胞中CTSC的表達(dá)水平高度相關(guān)(圖5f)。這表明上皮細(xì)胞CTSC的表達(dá)升高可能是Macro_APOE/NRG1募集或分化的原因。研究也發(fā)現(xiàn)TNFRSF4(OX40)是FOXP3+和CD25+ Treg亞群之間的顯著DEGs(圖5g)，此外它在IL2-STAT5信號通路中富集(圖5h)。ST數(shù)據(jù)也證實了在OSCC起始階段，TNFRSF4+ Treg細(xì)胞及TNFRSF4表達(dá)呈上升趨勢(圖5i, k, l)。研究也觀察到CD8_Tem與TNFRSF4+ Treg細(xì)胞的比例從N階段到T階段保持穩(wěn)定或逐漸下降(圖5j)。此外沒研究在早期OSCC樣本中對APOE, CD68, FOXP3和OX40的mIHC染色進(jìn)一步驗證了這些免疫細(xì)胞參與了DN向T階段的轉(zhuǎn)變過程(圖5m)。
7. DN期存在VEGF信號通路的空間轉(zhuǎn)換調(diào)控
這一部分研究對經(jīng)典癌癥通路VEGFA進(jìn)行了分析。研究首先通過細(xì)胞互作分析發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞分泌的VEGFA自DN階段起就與基質(zhì)細(xì)胞上的受體相互作用(圖6a)。從OSCC起始組織的VEGFA染色中，研究觀察到VEGFA在N區(qū)和DN區(qū)上皮的上層高表達(dá)(圖6b)。接著研究在病理專家的指導(dǎo)下，根據(jù)角化過度和不典型增生將N和DN區(qū)上皮分為兩部分，分別為上皮的上下層(圖6c)，結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)與N和DN區(qū)域的下層相比，VEGFA信號在上層表現(xiàn)出顯著的表達(dá)增強(圖6d, e)。除了VEGFA信號外，研究也在N區(qū)和DN區(qū)上層觀察到了CD68+細(xì)胞和CD68+ VEGFA+信號(圖6f, g)。
8. 確定的免疫亞群在OSCC發(fā)病中的臨床相關(guān)性
在文章的最后一部分研究對免疫亞群在OSCC發(fā)病中的臨床相關(guān)性進(jìn)行了分析。研究首先通過mIHC染色證實初發(fā)輕度白斑和伴中重度異型增生白斑的微環(huán)境中，CD68+和APOE+巨噬細(xì)胞、FOXP3+和TNFRSF4+Tregs、VEGFA和TGFβ信號的表達(dá)水平不同(圖7a, b)，其中初發(fā)白斑的微環(huán)境中，TGFβ信號的表達(dá)水平較低，淋巴細(xì)胞浸潤有限(圖7a)，相反中度至重度不典型增生的活檢中CD68+及VEGFA+單核細(xì)胞、TNFRSF4+ Treg以及VEGF和TGFβ1信號則增強(圖7b)。接下來，作者在小鼠中建立了癌變模型來探索這些細(xì)胞亞群的功能(圖7c)。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射抗TGFβ和抗PD-1抗體的小鼠在20周時要么表現(xiàn)出肉眼可見的菜花樣病變，要么在舌頭上表現(xiàn)出相對粗糙的表面(圖7d)。在對每組的菜花狀病變進(jìn)行定量后，作者發(fā)現(xiàn)所有治療組與未治療組相比，顯著地表現(xiàn)出較輕的病變，表明這些抗體對OSCC起始具有干預(yù)作用(圖7e, f)。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了。文章聚焦于口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期階段，納入了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，將生信分析與實驗相結(jié)合，對觸發(fā)癌癥發(fā)生的因素及癌癥早期的微環(huán)境進(jìn)行了全面分析，內(nèi)容豐富邏輯清晰，值得我們參考學(xué)習(xí)。
