說(shuō)到今天的兩個(gè)配角:CRISPR基因編輯技術(shù)和single cell測(cè)序技術(shù),那都是大家在近幾年科研界耳熟能詳?shù)募夹g(shù)了。在如今的各個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,我們都能經(jīng)常看到由這兩種技術(shù)主導(dǎo)而發(fā)表的CNS主刊,特別是CRISPR基因編輯技術(shù)還獲得了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。小編覺(jué)得未來(lái)說(shuō)不定哪一年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)也可以獲得諾貝爾獎(jiǎng),讓我們拭目以待!
但是,Immugent今天要說(shuō)的主角既不是CRISPR基因編輯技術(shù)也不是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù),而是它倆的王炸組合--Perturb-Seq技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)最初是由基因編輯大神張鋒和Paola Arlotta在2020年提出,相關(guān)文章發(fā)表在Science雜志上,這項(xiàng)技術(shù)可以同時(shí)研究活生物體中許多不同細(xì)胞類(lèi)型中不同基因的功能,有關(guān)這篇文章的細(xì)節(jié)見(jiàn)本文第一個(gè)章節(jié)。
總的來(lái)說(shuō),通過(guò)基因組測(cè)序工作,科學(xué)家已經(jīng)鑒定出大量基因,這些基因一旦發(fā)生突變,就會(huì)與人類(lèi)疾病有關(guān)。傳統(tǒng)上,理解這些基因的作用需要對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行深入研究。通過(guò)開(kāi)發(fā)用于體內(nèi)應(yīng)用的Perturb-Seq,我們可以開(kāi)始以更有效的方式在動(dòng)物模型中篩選所有這些基因,從而使我們能夠從機(jī)理上理解這些基因突變是如何導(dǎo)致疾病。廢話不多說(shuō),下面小編就通過(guò)4篇高分文章系統(tǒng)解讀一下Perturb-Seq技術(shù)的發(fā)展和使用。
1. Perturb-Seq的提出
Perturb-seq技術(shù)最初由來(lái)自Broad研究所的Xin Jin、Aviv Regev、張峰和Paola Arlotta在Science雜志發(fā)表的文章In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes中提出,他們研發(fā)出一種可以進(jìn)行體內(nèi)大規(guī)模遺傳功能研究的測(cè)序技術(shù)。
圖1:
在這項(xiàng)研究中,研究者首先利用CRISPR-Cas9在35個(gè)ASD/ND新發(fā)風(fēng)險(xiǎn)基因中引入移碼突變,隨后轉(zhuǎn)染進(jìn)子宮內(nèi)發(fā)育的小鼠大腦中,然后對(duì)出生后大腦中受到干擾的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。測(cè)序分析從神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)中鑒定出細(xì)胞類(lèi)型特異和進(jìn)化保守的基因模塊。這些風(fēng)險(xiǎn)基因的擾動(dòng)會(huì)影響到神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中反復(fù)出現(xiàn)的基因模塊和細(xì)胞類(lèi)型,證明這些風(fēng)險(xiǎn)基因?qū)﹃P(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程的影響。很多基因變異在不同的細(xì)胞或組織器官里往往能有不同的功能,但傳統(tǒng)的bulk RNAseq往往隱沒(méi)了這些基因在少數(shù)細(xì)胞的功能。因此,作者建立了活體內(nèi)的Perturb-seq系統(tǒng),它可以做到在一個(gè)發(fā)育胚胎中引入基因編輯來(lái)敲除疾病相關(guān)的基因,然后兩周后在發(fā)育后的腦細(xì)胞里進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。用這個(gè)高通量方法作者就一次性檢測(cè)了35個(gè)自閉癥相關(guān)基因,并且檢測(cè)他們?cè)诓煌哪X細(xì)胞中的功能。
圖2:
最后,研究人員對(duì)現(xiàn)有的人類(lèi)組織的的scRNA-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)(包含成人大腦皮質(zhì)、ASD供體皮質(zhì)和匹配對(duì)照組、胎兒人類(lèi)皮質(zhì)以及3個(gè)月、6個(gè)月大的人腦類(lèi)器官)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因模塊都在人類(lèi)數(shù)據(jù)是保守存在的。其中8個(gè)模塊顯示出更多的模塊內(nèi)相關(guān)性,而且相關(guān)性也隨著人類(lèi)樣本的年齡而增加。隨后,作者進(jìn)一步利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)集定義出ASD病人中不同類(lèi)型細(xì)胞中差異表達(dá)的基因,并且在小鼠中發(fā)現(xiàn)了有1:1同源類(lèi)似物的基因共14個(gè)。分析顯示中間神經(jīng)元的SST和興奮性神經(jīng)元的NRN1在ASD病人中表達(dá)降低,與Perturb-Seq試驗(yàn)中表達(dá)顯著減少相一致。這表明Perturb-Seq技術(shù)可以準(zhǔn)確的鑒定出人類(lèi)ASD病人中存在的基因表達(dá)異常。
2. Perturb-seq用于癌癥編碼變體的大規(guī)模檢測(cè)
基因組測(cè)序研究已經(jīng)確定了癌癥中數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的體細(xì)胞變異,但進(jìn)一步的預(yù)測(cè)大多數(shù)變異表型所影響仍然具有挑戰(zhàn)性。以往區(qū)分有影響的變異體的實(shí)驗(yàn)方法通常是使用表型檢測(cè),這些方法報(bào)道了大量細(xì)胞群中預(yù)定義的基因特異性功能影響。鑒于此,美國(guó)羅德研究所的Jesse S. Boehm、Aviv Regev等研究人員,利用Perturb-seq對(duì)癌癥中的編碼變體進(jìn)行了大規(guī)模并行檢測(cè)。相關(guān)研究作為Article在今年發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上,篇名為:Massively parallel phenotyping of coding variants in cancer with Perturb-seq。
圖3:
為了評(píng)估癌基因相關(guān)變異的功能,研究者對(duì)基于sc-eVIP的Perturb-seq技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,希望能實(shí)現(xiàn)通過(guò)外源性的引入DNA條碼的方式來(lái)標(biāo)記癌基因中變體,從而可以在單細(xì)胞水平的下誘導(dǎo)不同的基因表達(dá)狀態(tài)。如果誘導(dǎo)的基因變體表達(dá)與野生型基因相似,則將該類(lèi)別基因變體稱(chēng)為野生類(lèi)似型(WT-like),其他情況則認(rèn)為該基因變體對(duì)其功能和表型存在影響。作者們克隆了每個(gè)基因變體編碼序列,然后加入不同的DNA條碼進(jìn)行標(biāo)記,對(duì)其單細(xì)胞水平上的影響進(jìn)行評(píng)估。
圖4:
隨后,研究者又將Perturb-seq技術(shù)應(yīng)用于對(duì)KRAS基因變體功能的評(píng)估中,對(duì)101個(gè)KRAS基因變體的功能進(jìn)行檢測(cè)。首先,研究者證實(shí)了可以在A549肺癌細(xì)胞系中準(zhǔn)確區(qū)分外源表達(dá)的KRAS,隨后就對(duì)大規(guī)模單細(xì)胞表達(dá)KRAS基因變體在癌細(xì)胞系中的表型進(jìn)行評(píng)估。這些KRAS基因變體的表型可以分為野生類(lèi)型、功能獲得型以及功能缺失型突變。功能獲得型突變類(lèi)群變體所存在的位點(diǎn)主要落在KRAS基因的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域之中,另外有18個(gè)變體處于野生型類(lèi)似型的基因變體類(lèi)群之中,但是也會(huì)在腫瘤中出現(xiàn)??傊琍erturb-seq技術(shù)幫助構(gòu)建了一種KRAS基因功能或者說(shuō)表型的漸變狀態(tài)的衡量方式。
3. Perturb-seq繪制首個(gè)人類(lèi)基因-表型綜合圖譜
自從單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被商業(yè)應(yīng)用后,我們經(jīng)??梢栽诟鞔箅s志的文章中見(jiàn)到各式各樣的圖譜研究報(bào)道。這類(lèi)文章通常以某一物種或者組織的大量測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),通過(guò)在單個(gè)細(xì)胞水平揭示研究對(duì)象的細(xì)胞亞群構(gòu)成。Perturb-seq毫無(wú)疑問(wèn)是更強(qiáng)大的,其可以更進(jìn)一步的在單細(xì)胞水平檢測(cè)出CRISPR sgRNA擾動(dòng)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄影響的技術(shù)。因此,為了建立一個(gè)全面理解的細(xì)胞功能的圖譜,2022年6月9日,美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校Jonathan S. Weissman研究組與紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥中心Thomas M. Norman研究組合作在Cell雜志上發(fā)表了題為Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq的研究。
圖5:
為了揭示基因擾動(dòng)的功能后果和基因型-表型關(guān)系,研究人員使用人類(lèi)血癌細(xì)胞系,以及來(lái)自視網(wǎng)膜的非癌細(xì)胞,對(duì)超過(guò)250萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了Perturb-seq,并使用這些數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)基因型-表型綜合圖譜。研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)基因的共同調(diào)控將其聚類(lèi)到特定表達(dá)程序中,并計(jì)算每個(gè)擾動(dòng)簇中每個(gè)基因表達(dá)程序的平均活性。分析結(jié)果包含多個(gè)與基因干擾相關(guān)的已知表達(dá)程序,包括蛋白酶體功能障礙導(dǎo)致的蛋白酶體亞基上調(diào)、 ESCRT蛋白缺失時(shí)NF-kB信號(hào)通路的激活,以及膽固醇生物合成上調(diào)對(duì)囊泡運(yùn)輸缺陷的反應(yīng)等。
圖6:
當(dāng)前,醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一個(gè)關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題,就是如何理解細(xì)胞核和線粒體基因組的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)線粒體壓力。在這項(xiàng)最新研究中,作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為探究這一問(wèn)題提供了可能。為了確定基因擾動(dòng)引起的差異表達(dá)模式,研究者檢測(cè)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)在線粒體基因組中的分布。為了驗(yàn)證這種基于位置的分析的有效性,首先證實(shí)了已知線粒體轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(TEFM)和RNA降解(PNPT1) 的敲除會(huì)導(dǎo)致線粒體基因組位置發(fā)生重大變化。相比之下,研究發(fā)現(xiàn)許多基因擾動(dòng)似乎導(dǎo)致了mRNA相對(duì)豐度的變化,而不是位置排列的總體變化。鑒于觀察到的反應(yīng)的復(fù)雜性,研究人員提出可能有多種機(jī)制影響不同線粒體編碼轉(zhuǎn)錄本的水平,以應(yīng)對(duì)不同的壓力。
4. Perturb-seq揭示調(diào)控T細(xì)胞衰竭的關(guān)鍵基因
在腫瘤免疫領(lǐng)域的研究中,一個(gè)很關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題就是T細(xì)胞衰竭。在過(guò)去的幾十年里,研究人員都在從不同角度去探索這個(gè)令人頭大的科學(xué)問(wèn)題。2022年6月23日,來(lái)自斯坦福大學(xué)的Ansuman T. Satpathy 團(tuán)隊(duì)同樣是利用Perturb-seq技術(shù)在Cancer Cell 上發(fā)表題為Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence 的文章。作者通過(guò)構(gòu)建CRISPR篩選體系,揭示了耗竭T細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)相關(guān)染色體重塑和核小體組裝的基因是調(diào)節(jié)耗竭狀態(tài)的關(guān)鍵基因。
圖7:
這項(xiàng)研究的作者開(kāi)發(fā)了一個(gè)T細(xì)胞衰竭模型,它可以用于研究培養(yǎng)皿中分離的免疫細(xì)胞的相關(guān)分子機(jī)制。眾所周知,不斷激活分離出來(lái)的T細(xì)胞受體可以很好地模擬腫瘤微環(huán)境中發(fā)生的生物過(guò)程。然后,研究人員使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),在細(xì)胞中改變數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因。他們測(cè)試了哪些T細(xì)胞在不斷激活受體后比平常表現(xiàn)出了更多或更少程度的衰竭。這一目的在于確定哪些基因在觸發(fā)T細(xì)胞衰竭中起著最至關(guān)重要的作用。
圖8:
研究人員在對(duì)調(diào)控T細(xì)胞衰竭的關(guān)鍵分子進(jìn)行篩選中,觀察到其中Arid1a、Smarcc1 和 Smarcd2是三個(gè)最重要的基因,它們都是cBAF復(fù)合物的組成分子。特別是將Arid1a敲除后,可以顯著阻礙了cBAF復(fù)合物的形成,從而進(jìn)一步提高體內(nèi)T細(xì)胞的持久性和抗腫瘤免疫效力,作者隨后在人耗竭T細(xì)胞也驗(yàn)證出Arid1a具有同樣的抗腫瘤潛力。此外,包括Arid1a在內(nèi)的cBAF亞基的敲除可以通過(guò)限制AP-1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)染色質(zhì)的可及性來(lái)改善T細(xì)胞功能,從而抑制與衰竭相關(guān)的染色質(zhì)狀態(tài)的獲得。進(jìn)一步分析顯示cBAF 和 INO80 染色質(zhì)重塑復(fù)合物在T細(xì)胞耗竭中具有不同的作用。cBAF主要調(diào)節(jié)效應(yīng)和耗竭相關(guān)基因,而INO80主要調(diào)節(jié)代謝。這也表明協(xié)同靶向多種途徑可以改善T細(xì)胞功能。
5.小結(jié)
想當(dāng)初,CRISPR基因編輯技術(shù)剛在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行應(yīng)用時(shí),就使我們具有研究任何一個(gè)基因的生物學(xué)功能的能力;而隨后的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)則是為我們提供了更加精細(xì)的、在單個(gè)細(xì)胞水平的視角,使我們不再會(huì)擔(dān)心因?yàn)榛祀s多種細(xì)胞而影響測(cè)序純度的問(wèn)題?,F(xiàn)如今,Perturb-seq技術(shù)的興起則是將這兩種革命性技術(shù)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合,使我們可以在任何細(xì)胞上研究任何基因的調(diào)控機(jī)制。
科技進(jìn)步之快已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)我們的想象,無(wú)論是在工程領(lǐng)域還是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都為我們提供了操作空間。如果說(shuō)上個(gè)世紀(jì)的醫(yī)學(xué)科研工作者還會(huì)因沒(méi)有實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)限制當(dāng)時(shí)的科學(xué)研究,現(xiàn)如今的醫(yī)學(xué)科技已經(jīng)基本可以滿足我們各種需求,而且我們還可以基于各種需求創(chuàng)造技術(shù)。因此,未來(lái)醫(yī)學(xué)科研的研究方向不應(yīng)該是以高新技術(shù)為主導(dǎo),即使它們也很重要,但是更多的科學(xué)研究應(yīng)該以解決重大科學(xué)問(wèn)題為導(dǎo)向。
雖然,小編今天介紹的這個(gè)Perturb-seq技術(shù)是十分強(qiáng)大的,但是目前還都只是美國(guó)的一些大型實(shí)驗(yàn)室在使用,未來(lái)幾年可能也會(huì)引入到國(guó)內(nèi)。即便如此,對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)還是具有很大挑戰(zhàn)的,因?yàn)檫M(jìn)行高質(zhì)量的CRISPR建庫(kù)是非常難的。此外值得注意的是,Perturb-seq的數(shù)據(jù)說(shuō)到底也是單細(xì)胞數(shù)據(jù),因此,和其它公共數(shù)據(jù)一樣,我們可以挖掘它們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)為我們自己的研究進(jìn)行服務(wù)。
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