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今天小編給大家介紹的是今年5月發(fā)表在Journal of Translational Medicine(if:8.440)上的一篇純生信公共數(shù)據(jù)庫挖掘的文章，題目為The potential crosstalk between tumor and plasma cells and its association with clinical outcome and immunotherapy response in bladder cancer，本文綜合了bulk RNA-seq、scRNA-seq和空間轉錄組數(shù)據(jù)揭示了在膀胱癌(BCs)中漿細胞(PCs)如何與腫瘤細胞交流，以及BCs患者對免疫檢查點抑制劑(ICIs)的反應和臨床結果的影響。
背景
膀胱癌(BCs)具有固有的侵襲性，易復發(fā)的特性，患者通常需要多模式、有創(chuàng)性的治療，但其無復發(fā)生存率較低。免疫檢查點抑制劑(ICI)相比其他治療方法具有更好的安全性和更持久的反應，對進一步改善患者的臨床管理和預后具有重要意義。腫瘤相關的三級淋巴結構(TLSs)最近被發(fā)現(xiàn)，并與BC患者更好的生存和免疫反應相關，TLSs中不僅含有大量的T細胞，還含有大量的ICI反應性B細胞，漿細胞(PCs)是TLSs中關鍵的B細胞群，腫瘤相關的巨噬細胞、成纖維細胞和中性粒細胞已被報道與B細胞相互作用并介導其向PC的分化。然而，目前尚不清楚PC是否直接與腫瘤細胞相互作用，以及腫瘤細胞-PC通訊在BC中起什么作用。
實驗設計
圖1 流程圖
結果
1. PCs與患者生存和對免疫治療的反應有關
本章節(jié)作者基于TCGA-BLCA bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的細胞浸潤推斷分析。在單變量Cox回歸模型中，11種免疫細胞類型與總生存期(OS)顯著相關，在所有B細胞類型中，只有class-switched memory B細胞和PCs與更好的OS顯著相關(圖2A和B)。在抗PD-L1處理的IMvigor210隊列中的B細胞中，只有PCs與較好的OS相關(圖2C和D)。此外，免疫治療應答患者的PC豐度相對較高(圖2E)。這些基于大量測序數(shù)據(jù)的細胞推斷結果表明，BC患者的高PC浸潤預示著更好的OS和對免疫治療的反應。
圖2 從bulk RNA-seq數(shù)據(jù)推斷的漿細胞浸潤水平與生存和免疫治療反應相關
2. IgG1和IgA1是BC中PCs的兩個主要亞型
本章節(jié)作者納入了一個scRNA-seq數(shù)據(jù)集來探索單細胞水平上PC的異質性。經(jīng)過質控和細胞篩選，將其注釋成三個大細胞亞群：上皮細胞(KRT18、EPCAM)，基質細胞(VWF、COL1A1)，免疫細胞(PTPRC、CD19、MS4A2)(圖3A、B)。其中，依據(jù)PC標記物Cluster 11被鑒定為PCs(圖3C、E)。與低級別患者相比，高級別患者的PCs減少(圖3D上)。接下來，將未表達naive B細胞標記物的PCs進一步細分為7個簇(圖3D下)，表明這些細胞都是成熟的PCs(圖3E)。由于增殖相關基因MKI67的高表達，集群4被鑒定為質母細胞，而其他細胞主要表達IGHG1和IGHA1(圖3F)。通過PCA進行基因降維后，我們發(fā)現(xiàn)幾乎所有的PC都是高表達IGHG1和IGHA1的細胞，并且存在多個IgG亞型的細胞重疊。散點圖也顯示了兩種細胞類型之間的顯著差異(圖3G)，表明IgG1和IgA1 PC是BC中主要的PC類型。為了進一步探究其功能特征，作者將IGHG1高表達、IGHA1低表達的細胞定義為IgG1 PCs，將IGHG1低表達、IGHA1高表達的細胞定義為IgA1 PCs。其中IgA1 PCs主要參與細胞周期相關的通路調控，而IgG1 PCs則顯著參與免疫應答(圖3G)。通過偽時間軌跡分析發(fā)現(xiàn)IgA1 PCs位于軌跡起點，IgG1 PCs主要位于軌跡末端(圖3H)。同時，作者還發(fā)現(xiàn)IGHA1表達在軌跡結束時下降，而IGHG1表達增加(圖3I)，這表明IgA1和IgG1 PCs之間可能存在類切換關系。進行細胞比例分析，作者發(fā)現(xiàn)在高級別疾病患者中IgA1 PCs增加，IgG1 PCs減少(圖3J)。
圖3 單細胞分析鑒定漿細胞亞群
3. 六種腫瘤細胞狀態(tài)的鑒定
本章節(jié)作者使用非負矩陣分解法(NMF)將腫瘤細胞鑒定為六種狀態(tài)。根據(jù)對單細胞的拷貝數(shù)推斷分析，腫瘤細胞來自具有顯著拷貝數(shù)變異(CNV)的上皮細胞(圖4A)，來自高級別患者的細胞具有更高的CNV評分(圖4B)。作者在BC中鑒定了六種腫瘤細胞狀態(tài)(周期、基礎、缺氧、部分上皮-間質轉化[pEMT]、干擾素和應激)用于評估腫瘤細胞的內在功能特征(圖4C和D)，發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)的腫瘤細胞參與不同的調節(jié)功能(圖4D)。盡管干擾素樣腫瘤細胞的細胞比例最低，但它們的CNV評分最高(圖4E)。
圖4 用NMF鑒定六種細胞狀態(tài)
4. 腫瘤細胞與PC間的串擾景觀
本章節(jié)作者研究了所有細胞主要是腫瘤細胞與PC之間的通訊。在配受體(L/R對)分析中，MIF/ (CD74+CD44或+CXCR4)和APP/CD74的L/R對是腫瘤細胞到PC信號轉導中最突出的相互作用(圖5A)。此外，在基于抗PD-L1治療隊列的L/R對與患者OS的相關性分析中，一些L/R對介導缺氧樣和應激樣腫瘤細胞向IgG1 PC(如ANGPTL4/SDC1和LAMB3/ CD44)的信號轉導，顯示出與患者OS惡化的顯著相關性，表明這些L/R對可能在接受ICB治療的患者中發(fā)揮特定作用。另一方面，一些趨化因子信號相關分子(如CXCL10和CXCL11)與患者更好的OS相關(圖5A)，這些趨化因子由pEMT樣腫瘤細胞分泌，可能通過ACKR1促進IgG1 PC的募集。
作者進一步研究了58對參與腫瘤細胞與PC之間重要通訊的L/R對的表達水平。在TCGA-BLCA隊列中，33個分子在腫瘤和正常樣本中差異表達，其中64%的分子在腫瘤樣本中上調(圖5B和C)。在抗PD-L1治療IMvigor210隊列中，16個分子在治療應答和無應答患者中差異表達，但在應答患者中只有40%的分子上調(圖5B和C)。由此作者推測腫瘤細胞和PC之間的全局串擾可能促進癌癥的發(fā)展，并與對ICB治療的不良反應有關。
為了進一步選擇腫瘤細胞和PC之間可靠的L/R對，作者使用空間轉錄組分析評估了它們在組織切片中的表達水平?；贚/R對的表達和生物學定位分析，作者鑒定出腫瘤細胞與PCs之間具有高可靠性的兩個L/R對(LAMB3/CD44和ANGPTL4/SDC1)。然而，作者發(fā)現(xiàn)ANGPTL4低表達，這表明其可能僅由某些特定的腫瘤細胞分泌。作者檢測了ANGPTL4在不同細胞類型中的表達，發(fā)現(xiàn)它在上皮(腫瘤)細胞中顯著表達，在一些基質細胞中表達程度較低(圖5E)。在樣本來源分析中，在樣本B5和B7中觀察到ANGPTL4明顯的樣本偏倚，這可能與它們明顯的缺氧水平有關(圖5F和G)。缺氧條件誘導ANGPTL4表達。由此作者認為缺氧腫瘤細胞可能分泌ANGPTL4與SDC1+ PCs進行通訊，從而影響其分化、存活和抗體分泌。
圖5 PC與腫瘤細胞之間潛在的配體和受體相互作用
5. 基于L/R對的風險模型構建
在這一章作者進一步量化了腫瘤細胞和PCs之間的串擾模式，并評估了它們與患者生存和免疫治療的關系。基于TCGA-BLCA隊列，作者從58對參與腫瘤細胞與PC之間顯著通訊的L/R對中選取13個分子構建風險模型(圖6A)，發(fā)現(xiàn)LR評分高組患者的OS明顯較差(圖6B)。在單因素Cox分析中，Stage、T Stage和N Stage也與OS顯著相關(圖6C)，而在多因素Cox分析中，剔除混雜因素后，LRscore是唯一獨立的BC患者預測因子(圖6C)。1年、3年、5年、7年和10年生存率的tdROC曲線下面積(AUC)表明，LRscore是比Stage、T Stage和N Stage更穩(wěn)定有效的指標(圖6D)。此外，在BC患者中，高LRscore也與較差的DSS、DFS和PFS相關(圖6E)，這表明LRscore也有預測患者復發(fā)和進展的潛力。作者進一步評估了LRscore對抗PD-L1治療隊列患者生存的影響，高LRscore也預示著更差的OS(圖6F)。同時，高風險組對治療有反應的患者較少(圖6G)，這表明LRscore可能與患者對ICB治療的反應較差有關。LRscore與TNB和TMB 的顯著負相關進一步驗證了這一發(fā)現(xiàn)(圖6H)。此外，模型分子ITGA6、HSPG2、LAMB1和SDC2的表達在應答患者中較低，這些分子的低表達與較差的OS相關(圖6I和J)。這些模型分子可能是該模型成功預測抗PD-L1治療隊列免疫反應的主要原因。最后，作者評估了LRscore與其他免疫治療相關預測因子(TNB、TMB、PD-L1、PD1和PCs)的預測效果(圖6K)。LRscore聯(lián)合TNB和TMB獲得最高的AUC，診斷特異性為85.7%，可用于避免患者過度免疫治療。
圖6 基于配體(L)和受體(R)的風險模型LRscore是一個很好的預后和免疫預測因子
6. 評估風險模型
為了更好地分析LR風險模型的特征，作者基于TCGA-BLCA隊列評估了LRscore與癌癥特征之間的相關性(圖7A)。LRscore與大多數(shù)癌癥標志呈正相關，如上皮-間質轉化、血管生成、刺猬信號和缺氧。免疫細胞浸潤分析顯示，LRscore與大多數(shù)腫瘤抑制T細胞類型(圖7B)和IPS 呈負相關(圖7E)。IPS是一種免疫原性評價指標，IPS越高，免疫治療效果越好。然而，LRscore與內皮細胞和基質細胞評分呈正相關，而與效應細胞(ECs)、免疫檢查點(CPs)或整體免疫評分呈正相關(圖7C和E)。更重要的是，LRscore與腫瘤免疫功能障礙及排斥(TIDE)評分之間也存在顯著正相關，這種相關性主要來自于排除和CAFs，而非功能障礙(圖7D)。這些數(shù)據(jù)表明，LRscore反映的免疫抑制狀態(tài)可能主要是由于腫瘤基質對免疫浸潤的抵抗。
此外，低風險組的患者大多被分類為BC的經(jīng)典Robertson-LumP和共識kamoun-LumP分子亞型，而高風險組則與惡性亞型相關，如Ba/Sq、Robertson-Neuronal和kamoun-NE樣亞型(圖7F)。在低風險組中，腫塊亞型顯示出高的FGFR3突變頻率(圖7G)。作者還基于GDSC藥物數(shù)據(jù)庫對不同風險組進行了藥物敏感性分析，低風險組患者對FGFR3靶向藥物(如PD173074和AZD4547)的敏感性更高(圖7H)。FGFR3可能成為低風險組患者的藥物靶點?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，高LRscore預示著患者的高免疫排斥和低免疫原性，這表明較差的免疫治療反應和OS，但低LRscore的患者可能具有更好的免疫和靶向治療結果。
圖7 LRscore與癌癥進展、微環(huán)境、癌癥亞型和體細胞突變的關系
小結
在這項研究中，作者首先對來自8名患者的41894個細胞進行了scRNA-seq調查，并探索了腫瘤細胞與PCs之間的通訊模式；接下來，作者進一步通過空間轉錄組表達分析鑒定了關鍵配體/受體對，以闡明特定狀態(tài)的腫瘤細胞與PCs之間的串擾；最后，作者量化了腫瘤細胞和PCs之間的總體串擾，以評估其對患者生存和對ICB治療的反應的影響。這種多維綜合分析為BC患者PCs的細胞異質性和串擾模式提供了前所未有的見解。
總之，作者通過整合scRNA-seq、bulk RNA-seq和空間轉錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地表征了BC中腫瘤細胞和PCs之間的串擾模式，并量化了這種串擾對患者生存和免疫治療反應的潛在影響，基于L/R對的LRscore風險模型可用于預測臨床風險和免疫反應。
