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給大家?guī)?lái)一篇發(fā)表在《Cancers》(if:6.86)上的文章，腫瘤分子亞型的建立促進(jìn)了研究人員對(duì)腫瘤基因型和表型的認(rèn)識(shí)，在治療和預(yù)后評(píng)估方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這篇干濕結(jié)合的文章，利用共識(shí)分子聚類方法將肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌（MIBC）劃分為6個(gè)分子亞型，系統(tǒng)揭示了6個(gè)分子亞型的特異性分化模式、突變基因、組織學(xué)和總體生存率。接下來(lái)小編帶大家一起閱讀一下這篇文章。
肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌(MIBC)是一種具有相當(dāng)異質(zhì)性的惡性腫瘤。MIBC腫瘤微環(huán)境(TME)是高度復(fù)雜的，包括不同的表型和空間結(jié)構(gòu)。必須對(duì)MIBC TME的復(fù)雜性進(jìn)行描述，以提供精確治療的潛在靶點(diǎn)。本研究采用大細(xì)胞計(jì)數(shù)和成像大細(xì)胞計(jì)數(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)44例MIBC患者的腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和TME空間特征進(jìn)行分析。研究人員檢測(cè)到異常表型的腫瘤和免疫細(xì)胞簇。特別是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)以前被忽視的癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞集群(ALDH + PD-L1 + ER -β恖)是與不良預(yù)后密切相關(guān)。研究人員闡明了在MIBC TME中免疫細(xì)胞(排除、浸潤(rùn)和廢棄)和腫瘤相關(guān)膠原(彎曲、拉伸、方向分布和混亂)的不同空間結(jié)構(gòu)。
目前這個(gè)研究是第一個(gè)在單細(xì)胞水平上深入了解MIBC TME復(fù)雜性的研究。研究人員的結(jié)果將提高對(duì)MIBC異質(zhì)性特征的普遍理解，潛在地促進(jìn)患者分層和個(gè)性化治療。
為了繪制MIBC的TME圖，使用CyTOF(質(zhì)譜流式細(xì)胞儀)評(píng)估44例患者的79個(gè)樣本(圖S1)，包括44個(gè)癌(CA)組織和35個(gè)癌旁(CP)組織。采用t-SNE算法對(duì)高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，。對(duì)MIBC TME中單個(gè)細(xì)胞的分析顯示了各種獨(dú)特的蛋白表達(dá)模式(圖1A)。為了檢測(cè)TME中的特定聚類，使用表型算法識(shí)別了21個(gè)表型不同的聚類(圖1B)。CA和CP組織的聚類分析顯示，CA和CP組織中許多聚類的頻率不同，說(shuō)明CA和CP組織中TME的構(gòu)成不同(圖1C)。研究人員檢測(cè)到7個(gè)特異性的CD326和CD45陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)具有免疫細(xì)胞和腫瘤上皮細(xì)胞的特征。這21個(gè)特定的聚類顯示出個(gè)體樣本之間的高度異質(zhì)性(圖1E)。在MIBC TME中，腫瘤細(xì)胞簇表現(xiàn)出不同的蛋白表達(dá)模式(圖1D)。
為了進(jìn)一步探索特定群集的特征，研究人員根據(jù)每個(gè)群集的頻率將患者分層，分為高豐度組和低豐度組。值得注意的是，SPADE分析顯示，與低豐度組患者相比，聚10高豐度組患者腫瘤上皮細(xì)胞高表達(dá)c-Myc、Ki67、vimentin，提示高豐度組患者可能呈現(xiàn)上皮-間充質(zhì)過(guò)渡(epithelial-mesenchymal transition, EMT)狀態(tài)和高增殖率。集群18顯示出與集群10相同的模式(圖2A,B)。
為揭示MIBC生態(tài)系統(tǒng)聚類間的關(guān)系，采用spearman秩相關(guān)分析。顯示了MIBC TME中集群之間的許多關(guān)系(圖2C)。腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞簇3、CD326+CD45+腫瘤上皮細(xì)胞簇10和18之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性(圖2D)，表明這些簇在TME中可能發(fā)揮著相似的作用，而腫瘤細(xì)胞簇與免疫細(xì)胞簇之間存在多種強(qiáng)相關(guān)性(圖2C)。上述結(jié)果表明，集群間的相互作用導(dǎo)致了MIBC TME的復(fù)雜性。
研究人員發(fā)現(xiàn)了一種以前未被欣賞的癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞集群ALDH + PD-L1 + ER -β恖集群(6)是與不良臨床結(jié)果(圖1 d和圖3)。根據(jù)聚類6的頻率將患者分為高豐度組和低豐度組，研究人員發(fā)現(xiàn)聚類6高豐度組患者與晚期和年齡相關(guān)(圖3B,C)。同時(shí)，聚6高豐度組63.6%的患者出現(xiàn)腫瘤脫分化，上皮細(xì)胞標(biāo)志物Pan-CK和E-cadherin表達(dá)缺失，而低豐度組只有27.8%的患者出現(xiàn)脫分化狀態(tài)(圖3F,G)。此外，IMC的空間分析顯示，聚類6位于腫瘤侵襲前方的間質(zhì)區(qū)域(圖3D,E)，代表了腫瘤出芽細(xì)胞的表型。
為了進(jìn)一步了解聚類6中高豐度組和低豐度組患者的分子特征，研究人員分析了這兩組患者之間的差異基因，發(fā)現(xiàn)許多差異基因在神經(jīng)元胞體中富集，對(duì)神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遷移等具有正調(diào)控作用。和其他神經(jīng)相關(guān)通路(圖3H)。在TCGA膀胱尿路上皮癌(BLCA)隊(duì)列中，高水平的B4GALNT1與臨床分期和不良預(yù)后顯著相關(guān)(圖4B,C)。在隊(duì)列研究中，與B4GALNT1表達(dá)顯著相關(guān)的基因在神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸、神經(jīng)元分化正調(diào)控和許多其他神經(jīng)相關(guān)通路中富集。免疫組化(IHC)染色和蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果顯示，B4GALNT1也位于間質(zhì)區(qū)，提示B4GALNT1與簇6關(guān)系密切。
DEGs富集分析顯示，B4GALNT1高表達(dá)組和低表達(dá)組成纖維細(xì)胞間主要上調(diào)的DEGs顯著富集于細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域、ECM和細(xì)胞外泌體(圖4D)。此外，通過(guò)GO分析高表達(dá)組和低表達(dá)組腫瘤上皮細(xì)胞中上調(diào)的deg，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外泌體是排在前列的信號(hào)通路;細(xì)胞外間隙和ECM在前20個(gè)信號(hào)通路中(圖4E)。高表達(dá)組成纖維細(xì)胞中HSPH1、HSPD1、HSPA6、HSPA1B、HSPA1A、HSP90AA1等熱休克蛋白表達(dá)上調(diào)(圖4F)。相關(guān)性分析表明,集群的時(shí)差B4GALNT1高表達(dá)患者顯著高于低表達(dá)患者(圖4 g H)和集群的空間分布B4GALNT1高表達(dá)患者比低表達(dá)患者更混亂,提示B4GALNT1高表達(dá)患者的TME中出現(xiàn)更多的細(xì)胞-細(xì)胞串?dāng)_(圖4I,J)。綜上所述，所有這些數(shù)據(jù)可能表明B4GALNT1通過(guò)激活細(xì)胞外泌體促進(jìn)細(xì)胞簇間的串?dāng)_，從而促進(jìn)MIBC進(jìn)展。
近年來(lái)，免疫治療是腫瘤治療的革命，它受腫瘤免疫微環(huán)境的影響。為了繪制MIBC的免疫微環(huán)境圖，研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)包含34種抗體的面板來(lái)分析MIBC生態(tài)系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的蛋白表達(dá)模式。為了獲得免疫細(xì)胞的蛋白表達(dá)，研究人員在細(xì)胞庫(kù)平臺(tái)上用免疫細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD45對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行門控。然后,通過(guò)t-SNE和phenograph算法被用來(lái)處理高維數(shù)據(jù)和識(shí)別19免疫細(xì)胞集群MIBC生態(tài)系統(tǒng)中不同的表型(圖5),包括6個(gè)CD4 + T細(xì)胞集群,5 CD8 + T細(xì)胞集群、2 B細(xì)胞集群,3 DC細(xì)胞集群,2巨噬細(xì)胞集群,集群NK細(xì)胞(圖5)。CA組織和CP組織中群集的頻率差異較大，說(shuō)明CA組織和CP組織的免疫微環(huán)境是不同的(圖5A,B)。
研究人員進(jìn)一步分析了單個(gè)腫瘤樣本中聚集的頻率，發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣本中都存在一個(gè)數(shù)量上具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的獨(dú)特的免疫細(xì)胞簇，表明單個(gè)樣本中的免疫細(xì)胞是異質(zhì)性的(圖5D)。T細(xì)胞在免疫微環(huán)境中具有抗癌和促癌雙重作用。在MIBC生態(tài)系統(tǒng)中，11個(gè)免疫檢查點(diǎn)、共抑制受體和激活標(biāo)記物表達(dá)模式不同的T細(xì)胞簇，如圖5C所示，代表耗盡或免疫抑制表型。
1.聚類16表現(xiàn)為高水平的PD-1 (CD279)、TIM-3、GranzymeB、CD27, CD95、HLA-DR、CTLA-4、ICOS (CD278)陽(yáng)性表達(dá)，為耗盡的CD8+ T細(xì)胞簇。
2.聚類10、12和13的PD-1、CTLA-4和HLA-DR表達(dá)呈陰性，而聚類17的標(biāo)記物表達(dá)模式與聚類16相同，但PD-1、ICOS、CTLA-4、HLA-DR和CD95表達(dá)水平較低。
3.聚類19高表達(dá)CD3、CD4和Foxp3，為Treg細(xì)胞簇，陽(yáng)性表達(dá)PD-1、TIM-3、HLA-DR，高表達(dá)CTLA-4、CD28、CD27、ICOS。
聚類11、14、15和18的標(biāo)記表達(dá)模式與聚類19相似，但表達(dá)水平較低(圖5C,E)。
分析不同聚類結(jié)果后，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)將病人分成高low-abundance組,根據(jù)每個(gè)集群的頻率,浸潤(rùn)T細(xì)胞的頻率,包括CD4 + T細(xì)胞、CD8 + T細(xì)胞亞群和PD-1 + T細(xì)胞在集群16豐富的集團(tuán),都顯著高于low-abundance組(圖5)。同時(shí)，聚16高豐度組PD-1+、TIM-3+和CTLA-4+免疫細(xì)胞的頻率也顯著高于低豐度組(圖5G)。簇16高豐度組的CD8+ T細(xì)胞、Tregs和巨噬細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)、共抑制受體和激活標(biāo)志物表達(dá)水平顯著高于低豐度組。集群19的模式與集群16相似(圖5F,G)。這提示群集16和群集19可能與MIBC的免疫抑制微環(huán)境有關(guān)。
最近，一項(xiàng)共識(shí)分子分類(ConMC)總結(jié)了已發(fā)表的分類和6個(gè)亞型的聚合MIBC的優(yōu)點(diǎn)，該分類基于來(lái)自18個(gè)已發(fā)表的數(shù)據(jù)集的1750個(gè)MIBC轉(zhuǎn)錄組譜。ConMC為MIBC研究提供了一個(gè)新的框架。在本研究中，研究人員根據(jù)ConMC將38個(gè)樣本分為6個(gè)分子亞型，并在單細(xì)胞水平上分析6個(gè)分子亞型之間的TME特征。而6個(gè)分子亞型的TME組分無(wú)顯著差異，說(shuō)明MIBC TME具有較大的異質(zhì)性，ConMC并沒有為MIBC TME研究奠定基礎(chǔ)。
成像質(zhì)量血細(xì)胞計(jì)數(shù)： 接下來(lái)，為了進(jìn)一步分析MIBC TME的復(fù)雜性，研究人員進(jìn)行了成像質(zhì)量血細(xì)胞計(jì)數(shù)(IMC)，以探索基于空間分辨率的MIBC TME表型。觀察Pan-CK(上皮細(xì)胞)、I型膠原(細(xì)胞外基質(zhì))和CD45(免疫細(xì)胞)，以鑒定MIBC TME的形態(tài)學(xué)特征。在TME中，研究人員觀察了腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和膠原蛋白信號(hào)的幾種主要空間表型。在腫瘤區(qū)域，出現(xiàn)兩種類型的tme;I型區(qū)域上皮細(xì)胞標(biāo)志物Pan-CK和E-cadherin表達(dá)強(qiáng)烈(圖6A)。同時(shí)II型區(qū)域PanCK和E-cadherin表達(dá)缺失，提示腫瘤發(fā)生脫分化(圖6B)。它常發(fā)生在預(yù)后差的樣本中。
免疫細(xì)胞： 免疫細(xì)胞在MIBC TME中也表現(xiàn)出三種主要的空間分布模式。在I型區(qū)域富集的免疫細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞排除，腫瘤細(xì)胞不浸潤(rùn)腫瘤巢(圖6C)。II型區(qū)域招募了浸潤(rùn)腫瘤巢的免疫細(xì)胞(圖6D)。III型區(qū)域免疫細(xì)胞較少(圖6E)。
膠原蛋白標(biāo)記空間分布： 同樣，在MIBC TME中出現(xiàn)了四種主要的膠原蛋白標(biāo)記空間分布模式。I型區(qū)包裹腫瘤巢的彎曲膠原纖維富集(圖6F)。II型區(qū)豐富的膠原纖維伸展并更平行于腫瘤邊界排列(圖6G)。III型區(qū)域含有定向分布的膠原纖維(圖6H)。IV型區(qū)域膠原纖維排列混亂，腫瘤邊界不清晰(圖6I)。這些結(jié)果表明，MIBC TME是高度復(fù)雜的；這就是為什么MIBC患者的治療反應(yīng)非常不同。
在個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，根據(jù)分子特征對(duì)患者進(jìn)行亞分組正成為決定癌癥預(yù)后和治療的關(guān)鍵因素。在本研究中，研究人員使用了CyTOF和IMC來(lái)研究MIBC TME的復(fù)雜性，揭示了TME的異質(zhì)性特征，比之前相關(guān)研究所了解的更為復(fù)雜。研究人員揭示了MIBC的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的不同表型，并確定了與不良預(yù)后相關(guān)的特定腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞簇。此外，本研究還分析了基于空間分辨率的免疫細(xì)胞表型和膠原蛋白特征。綜上所述，這個(gè)研究為今后的MIBC TME研究提供了資源，并可能為MIBC的精確治療提供方法。
