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炎癥免疫ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
今天給大家介紹的文章發(fā)表在期刊Journal of Clinical Periodontology上，這個(gè)期刊在最近一年的影響因子為8.728，比上一年增長(zhǎng)了3.487。中科院大類: 醫(yī)學(xué) 2區(qū)，中科院小類: 1區(qū) 牙科與口腔外科。該期刊雖然只收錄口腔科的文章，但這篇文章有很多值得我們學(xué)習(xí)的地方。文章思維簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)，非常值得我們借鑒。
思維導(dǎo)圖：
發(fā)現(xiàn)問題：
最近的研究主要集中在檢測(cè)MIAT在牙周組織中的表達(dá)水平。然而，它是否影響牙周炎的進(jìn)展仍不清楚。
背景知識(shí)：
牙周炎是一種非傳染性疾病，全球發(fā)病率和流行率很高。隨著疾病的進(jìn)展，牙齒支持組織發(fā)生炎癥和再吸收，最終導(dǎo)致牙齒脫落和全身炎癥。宿主的免疫反應(yīng)是破壞的主要原因。由于這些特點(diǎn)，免疫治療被認(rèn)為是一種很有前途的牙周炎新療法。
從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取牙齦組織的基因表達(dá)譜。進(jìn)行生物信息學(xué)分析，建立免疫相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。隨后，進(jìn)行功能富集分析，以檢測(cè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能參與的生物學(xué)過程。
DEL：differentially expressed lncRNAs，差異表達(dá)的lncRNA。
結(jié)果解讀：
差異表達(dá)的lncRNA的鑒定及分類模型的構(gòu)建
在隊(duì)列中，檢測(cè)到12個(gè)DEL。其中，4個(gè)在牙周炎樣本中上調(diào)，8個(gè)在牙周炎樣本中下調(diào)（Figure 1A）。為了進(jìn)一步縮小范圍，建立分類模型，作者進(jìn)行了LASSO Logistic回歸分析。隨著調(diào)諧參數(shù)λ的變化，相應(yīng)的DELS系數(shù)減小到零。最后，七個(gè)lncRNA (CDC42-IT1, LINC00592, MIAT, MIR210HG, MBNL1-AS1, SOX21-AS1, and LINC01133) formed the classification model (Figure 1B)。受試者工作特征(ROC)曲線分析表明，7個(gè)lncRNA的組合比單個(gè)lncRNA表現(xiàn)出更可靠的分類(Figure 1C)。分類模型的曲線下面積（AUC）為0.976。對(duì)于單個(gè)lncRNA，最高AUC值為0.907（MIAT）。通過計(jì)算隊(duì)列中的Youden指數(shù)(Youden指數(shù)=真陽性率+真陰性率-1)，確定了每個(gè)品種的最佳截止水平。與ROC分析結(jié)果相似，分類模型的尤登指數(shù)最高，達(dá)到0.880 (Figure 1D)。根據(jù)最佳分界值，將內(nèi)驗(yàn)證隊(duì)列中的樣本分為牙周炎組和健康組，7個(gè)lncRNAs的組合比單獨(dú)使用lncRNAs的分類效果更好(Figure 1E)。進(jìn)一步的ROC分析表明，內(nèi)部和外部驗(yàn)證隊(duì)列(GSE106090)的AUC值分別達(dá)到0.878和0.833，表明該分類模型具有較好的判別能力(Figure 1F)。這些結(jié)果表明，該模型可以有效地區(qū)分牙周炎樣本和健康對(duì)照。
Figure 1. Construction and validation of the classification model.
(A)火山圖顯示了牙周炎組織中差異表達(dá)的LncRNA，包括4個(gè)上調(diào)的LncRNAs和8個(gè)下調(diào)的LncRNAs。
(B)執(zhí)行交叉驗(yàn)證以篩選最佳調(diào)諧參數(shù)(λ)。
(C，D)ROC分析和Youden指數(shù)分析表明，該分類模型有足夠的能力區(qū)分牙周炎樣本和健康對(duì)照。
(E)分類模型的Youden指數(shù)也在內(nèi)部驗(yàn)證隊(duì)列中排名第一。
(F)內(nèi)部和外部驗(yàn)證隊(duì)列的ROC分析表明，分類模型具有令人滿意的判定能力。
7個(gè)選定的lncRNA與免疫signatures的相關(guān)性
由于lncRNAs在免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，作者探討了lncRNAs與免疫細(xì)胞的關(guān)系。使用R包“gsva”計(jì)算單個(gè)樣本的免疫signatures富集分?jǐn)?shù)。如小提琴曲線圖所示，牙周炎樣本中除CD56bright自然殺傷細(xì)胞、CD56dim自然殺傷細(xì)胞和Th2細(xì)胞外，大多數(shù)免疫信號(hào)顯著增強(qiáng)（Figure 2)。相反，效應(yīng)記憶CD4 T細(xì)胞在牙周炎樣本中表達(dá)下調(diào)。接下來，作者進(jìn)行了Spearman的相關(guān)性分析，以探索所選擇的七個(gè)lncRNA與免疫特征之間的關(guān)系。熱圖顯示，lncRNA MIAT與三種先天免疫信號(hào)（漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、髓系來源的抑制細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）和6個(gè)獲得性免疫亞群（活化的B細(xì)胞、未成熟的B細(xì)胞、中央記憶CD4T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th1細(xì)胞）呈正相關(guān)?；罨腂細(xì)胞與lncRNA MIAT的相關(guān)性最強(qiáng)。除Cdc42-IT1外，其余l(xiāng)ncRNAs與7個(gè)天然免疫細(xì)胞和7個(gè)獲得性免疫細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)<-0.6(lower part of Figure 2)。這些結(jié)果表明，分類模型中的7個(gè)LncRNA與免疫有很強(qiáng)的相關(guān)性。
Figure 2. Enrichment levels of immune subpopulations and their relationship with seven selected lncRNAs。上半部分顯示免疫細(xì)胞的分布。多數(shù)在牙周炎標(biāo)本中增加。下半部分顯示了免疫細(xì)胞與7個(gè)選定的lncRNA之間的關(guān)系。
篩選的7個(gè)lncRNAs對(duì)基因表達(dá)的潛在調(diào)控作用
基于這7個(gè)lncRNA組成的分類模型具有顯著的分類能力和與免疫的密切關(guān)系，作者進(jìn)一步進(jìn)行了WGCNA分析，以評(píng)估這7個(gè)lncRNA對(duì)基因表達(dá)的潛在調(diào)控作用。選擇調(diào)整p值小于0.05的差異表達(dá)mRNA。最后，作者鑒定了7個(gè)mRNA模塊，其中每個(gè)模塊至少與一個(gè)lncRNA有顯著的相關(guān)性，這表明這些與特定的mRNA模塊相關(guān)的lncRNA對(duì)基因表達(dá)有相似的調(diào)控作用(Figure 3A)。在這些模塊中，藍(lán)色模塊與lncRNA MIAT呈最強(qiáng)的正相關(guān)(correlation coefficient = 0.82)。選擇藍(lán)色模塊中的mRNA進(jìn)行進(jìn)一步的功能富集分析。結(jié)果表明，它們參與了許多與免疫相關(guān)的生物學(xué)過程，包括中性粒細(xì)胞的激活和脫顆粒；中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫；白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖；B細(xì)胞的激活；白細(xì)胞和B細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)(Figure 3B)。結(jié)合lncRNA MIAT與活化的B細(xì)胞呈正相關(guān)的觀察，作者重點(diǎn)研究了與B細(xì)胞活化和增殖相關(guān)的mRNAs。55個(gè)相關(guān)的mRNA參與了B細(xì)胞的激活過程，其中25個(gè)參與了B細(xì)胞的增殖調(diào)控，30個(gè)參與了B細(xì)胞的增殖(Figure 3C)。KEGG通路分析顯示，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、蛋白質(zhì)輸出、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、NF-κB信號(hào)通路和破骨細(xì)胞分化與藍(lán)色模塊的mRNA顯著相關(guān)(Figure 3D)。因此，lncRNA MIAT與這些富集基因形成的藍(lán)色模塊具有最強(qiáng)的正相關(guān)性，可能參與多種免疫應(yīng)答過程。
Figure 3. WGCNA and functional enrichment analysis.
(A)mRNA模塊與選定的lncRNAs之間的相關(guān)熱圖顯示，lncRNA MIAT與藍(lán)色模塊的正相關(guān)性最強(qiáng)。
(B)藍(lán)色模塊的生物過程富集分析。
(C)參與B細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)過程的mRNA。
(D)藍(lán)色模塊的KEGG途徑富集分析。
ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析
基于lncRNA MIAT與藍(lán)色模塊的高度相關(guān)性，作者進(jìn)一步構(gòu)建了基于MIAT、差異表達(dá)miRNAs(GSE54710)和藍(lán)色模塊mRNAs的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，作者確定了5個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)和100個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn)(Figure 4A)。牙周炎組miR-1246、miR-1260b和miR-4286表達(dá)下調(diào)，miR-3652和miR-1202表達(dá)上調(diào)(Figure 4B)。此外，還進(jìn)行了相關(guān)分析以篩選與lncRNA MIAT強(qiáng)相關(guān)的mRNAs。在27個(gè)強(qiáng)相關(guān)的mRNAs中，POU2F2、IFNAR2、LAX1和XBP1與LncRNA MIAT有較強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均在0.80以上。此外，27個(gè)篩選的mRNA構(gòu)建了一個(gè)亞ceRNA網(wǎng)絡(luò)(Figure 4C)。功能富集分析表明，它們與B細(xì)胞的各種生物學(xué)過程有關(guān)，包括B細(xì)胞的激活、增殖和分化以及免疫球蛋白的分泌和產(chǎn)生(Figure 4D and E)。
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Figure 4. Establishment of a ceRNA network.
(A)lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。菱形表示lncRNA，三角形表示miRNA，圓形表示mRNA。
(B)LncRNA MIAT、5個(gè)miRNAs和27個(gè)強(qiáng)相關(guān)mRNAs的表達(dá)水平。
(C)以lncRNA MIAT、4個(gè)miRNAs和27個(gè)篩選的mRNAs為基礎(chǔ)的ceRNA亞網(wǎng)絡(luò)。
(D) ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNAs的生物過程富集分析。
(E)豐富的mRNA及其參與的生物過程。
全文小結(jié)：
綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)，它可能參與調(diào)控牙周炎進(jìn)展過程中B細(xì)胞的增殖、分化和激活。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA MIAT可能競(jìng)爭(zhēng)性地與miR-1246、miR-1260b、miR-3652和miR-4286結(jié)合，促進(jìn)mRNAs的表達(dá)，從而影響B(tài)細(xì)胞的生物學(xué)過程。綜上所述，本研究為進(jìn)一步探討lncRNA MIAT在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制提供了新的參考，也為潛在的免疫治療靶點(diǎn)提供了新的參考。
