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在介紹這篇文章之前，我想介紹這篇文章的“美女”通訊作者Aviv Regev。
生物學(xué)家，人類細(xì)胞圖譜（HCA）創(chuàng)始成員之一。她和Teichmann現(xiàn)在是人體細(xì)胞圖譜計劃（Human Cell Atlas）的聯(lián)合負(fù)責(zé)人。該項目計劃對人體各種細(xì)胞的RNA進行測序，然后使用這些基因表達(dá)譜將細(xì)胞分類，定義新的細(xì)胞，并繪制所有細(xì)胞及其分子在空間上的組織方式。Regev還熱愛細(xì)胞。無論怎么看，對她來說，細(xì)胞都是神奇而迷人的。
結(jié)果解讀：
為了描述持久性細(xì)胞的增殖動力學(xué)，作者研究了PC9肺癌細(xì)胞對第三代EGFR酪氨酸激酶抑制劑osimertinib的反應(yīng)。PC9肺癌細(xì)胞編碼表皮生長因子受體(EGFR)的基因存在致癌突變。作者在最大效應(yīng)(Emax)濃度(300 Nm)下處理細(xì)胞，并使用活細(xì)胞成像來量化治療過程中分裂事件的數(shù)量和時間，因為細(xì)胞要么經(jīng)歷細(xì)胞死亡，要么受阻，要么形成可見的集落(圖1A)。為了確保來自集落形成譜系的細(xì)胞在作者的分析中不被過度表達(dá)，作者只跟蹤了每個譜系中的一個細(xì)胞。只有8%的細(xì)胞系產(chǎn)生了持久性細(xì)胞，其定義是在藥物治療的第14天存活的細(xì)胞(圖1B)。從根本不分裂的持久性細(xì)胞到經(jīng)歷了7次分裂，持久性細(xì)胞分裂譜顯示了廣泛的異質(zhì)性(圖1B)。這與未經(jīng)處理的親代細(xì)胞群體形成對比，在親代群體中，所有細(xì)胞都經(jīng)歷了細(xì)胞分裂(圖1C)。與以前報道的集落形成持續(xù)細(xì)胞很少一致，不到初始細(xì)胞群體的0.5%(持久群體的13%)產(chǎn)生了超過6個細(xì)胞的多細(xì)胞持久集落(圖1D)。因此，持續(xù)細(xì)胞包含一種在藥物治療早期出現(xiàn)的罕見的增殖亞群。
作者開發(fā)了Watermelon系統(tǒng)，這是一種高度復(fù)雜的條形碼慢病毒表達(dá)文庫，用于同時追蹤每個細(xì)胞的克隆起源以及增殖和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。要確定細(xì)胞在藥物治療中能否存活并恢復(fù)增殖能力的機制，需要在藥物治療前和藥物治療期間測量這些稀有細(xì)胞的細(xì)胞和分子特性。為此，作者開發(fā)了Watermelon系統(tǒng)，這是一個具有綠色和紅色熒光報告的高復(fù)雜性慢病毒條形碼文庫，用于同時追蹤克隆譜系以及種群中每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和增殖狀態(tài)。作者通過在mNeonGreen蛋白的3‘-非翻譯區(qū)定位克隆特異性表達(dá)的DNA條形碼來實現(xiàn)譜系追蹤，并通過稀釋強力霉素(Dox)誘導(dǎo)的H2B-mCherry轉(zhuǎn)基因來監(jiān)測增殖歷史(圖1E)。作者生成了一個包含500多萬個條形碼的Watermelon系統(tǒng)文庫，并用它轉(zhuǎn)導(dǎo)了10,000個感染復(fù)數(shù)(MOI)小于0.3的PC9細(xì)胞，以最大限度地減少克隆之間的條形碼重疊。
作者通過比較短時間循環(huán)和非循環(huán)的持續(xù)增殖群體的osimertinib敏感性，測試增殖性持續(xù)細(xì)胞是否出現(xiàn)對EGFR抑制的穩(wěn)定和較低的敏感性。作者用奧西美替尼處理Watermelon-PC9細(xì)胞14天，前三天在培養(yǎng)基中加入Dox。經(jīng)過11天的Dox處理，在此期間，mCherry只在增殖細(xì)胞中被稀釋，作者對循環(huán)和非循環(huán)的持久細(xì)胞進行了分類(圖1F)。循環(huán)和非循環(huán)的持久群體都迅速恢復(fù)了藥物敏感性，這表明在持續(xù)藥物治療下循環(huán)的能力是可逆的，而不是遺傳突變機制(圖1G)。為了確定持久細(xì)胞增殖能力的潛在機制，作者用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)(scRNA-seq)分析了56,419個Watermelon-pc9持久細(xì)胞在奧西美替尼治療14天的四個時間點(0，3，7和14天)的表達(dá)(圖2A)。作者使用已發(fā)表的signatures將每個細(xì)胞分配到特定的細(xì)胞周期時相(圖2B)，根據(jù)scRNA-seq檢測到的表達(dá)條形碼(圖2C)將細(xì)胞歸屬于譜系，并使用力定向布局嵌入(圖2D)。作者還根據(jù)相關(guān)細(xì)胞的輪廓將其歸類(圖2D)。與以前的報道一致，奧西美替尼在治療的第3天和第7天誘導(dǎo)G1期阻滯。在第14天，與中度循環(huán)細(xì)胞和非循環(huán)細(xì)胞(循環(huán)、中度循環(huán)細(xì)胞循環(huán)持續(xù)細(xì)胞分別有55%、36%和18%的細(xì)胞處于G2/M或S期)相比，循環(huán)持續(xù)細(xì)胞(根據(jù)mCherry稀釋度定義)具有更高的基于表達(dá)的細(xì)胞周期分?jǐn)?shù)(圖2B) 與作者基于成像的分析一致，在第14天出現(xiàn)在持續(xù)細(xì)胞內(nèi)的條形碼中，只有不到12%的條形碼是大規(guī)?？寺U增的一部分(定義為在14天的檢測過程中至少增加了5倍) ( Fig.2C )。
ScRNA-seq圖譜表明藥物治療后細(xì)胞狀態(tài)逐漸改變，循環(huán)和非循環(huán)持久細(xì)胞遵循不同的轉(zhuǎn)錄軌跡，周期持久細(xì)胞的子集類似于未經(jīng)處理的細(xì)胞(圖2D左)。治療過程中克隆大小動態(tài)檢測顯示克隆擴張，其中在循環(huán)持續(xù)細(xì)胞中觀察到的克隆大小增加最大 (圖2D，中)。幾乎三分之二的克隆有單一的命運，要么只產(chǎn)生循環(huán)的，要么只產(chǎn)生不循環(huán)的持久性細(xì)胞，而多命運譜系的出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期(圖2D，右)。第14天的單個克隆的大小在重復(fù)之間高度相關(guān)(圖2E)。
循環(huán)持續(xù)細(xì)胞比非循環(huán)持續(xù)細(xì)胞表現(xiàn)出更高的谷胱甘肽代謝和NRF2信號的表達(dá)，而非循環(huán)持續(xù)細(xì)胞的膽固醇穩(wěn)態(tài)、干擾素-α和Notch信號特征的表達(dá)更高(圖2F) 在較大克隆的細(xì)胞中高表達(dá)的前十個相關(guān)基因中，有五個是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NRF2的靶標(biāo)(Fig. 2H)。與最近作者的差異表達(dá)分析和NRF2在微小殘留病中的作用的報告一致，敲除了編碼NRF2負(fù)調(diào)控因子的Keap1，增加了循環(huán)持續(xù)細(xì)胞的比例(圖2I)。用熒光ROS報告器CellROX對奧西美替尼處理的細(xì)胞進行分析，發(fā)現(xiàn)ROS水平隨時間顯著增加(圖2J)。與觀察到的兩個持久亞群之間的表達(dá)差異一致，第14天的循環(huán)持續(xù)細(xì)胞表現(xiàn)出不到非騎行人群測量到的ROS水平的三分之一(圖2K)。此外，當(dāng)作者從第3天開始用活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)治療來緩解ROS (圖2L)，或者通過穩(wěn)定過表達(dá)GPX2(圖2M)時，循環(huán)持續(xù)細(xì)胞比例明顯增加。用抑制對谷胱甘肽合成至關(guān)重要的胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)的erastin治療，反過來減少了循環(huán)持續(xù)細(xì)胞的比例(圖2N)。
對229種量化代謝物的主成分分析(PCA)將循環(huán)持續(xù)細(xì)胞、非循環(huán)持續(xù)細(xì)胞和未處理群體分開(圖3A)。有56種代謝物在三個種群之間差異豐富(圖3B)。特別是，作為線粒體β氧化底物的肉堿連接脂肪酸在循環(huán)持續(xù)者中比非循環(huán)持續(xù)者中要豐富得多(圖3C)。作者研究了放射性標(biāo)記棕櫚酸氧化成3H2O的情況，以評估脂肪酸氧化(FAO)，并確實發(fā)現(xiàn)在奧西美替尼治療下，F(xiàn)AO的含量隨時間增加(圖3D)。接下來，作者測試了調(diào)節(jié)糧農(nóng)組織途徑是否會影響持久者的增殖能力。在Watermelon-PC9細(xì)胞中過表達(dá)CPT1A，一種促進脂肪酸轉(zhuǎn)移到線粒體的限速酶，導(dǎo)致奧西梅替尼處理14天后循環(huán)持續(xù)細(xì)胞的比例增加了50%以上(圖3e)。與依托莫昔爾共處理11天，在對未處理細(xì)胞有最小抑制作用的濃度下，顯著減少循環(huán)持續(xù)細(xì)胞的比例(圖3F)和過敏性細(xì)胞的總體比例(圖3G)。與之一致的是，敲除CPT1C（一種在人類肺癌17中上調(diào)的基因亞型），而不是CPT1A，導(dǎo)致循環(huán)周圍細(xì)胞的比例減少(圖3H)。為了研究這些發(fā)現(xiàn)對其他周圍細(xì)胞的共性，作者從EGFR驅(qū)動的肺癌(PC9和HCC827)、HER2驅(qū)動的乳腺癌(BT474和EFM192A)、BRAF驅(qū)動的黑色素瘤(A375和COLO858)和結(jié)直腸(HT29)細(xì)胞系中另外建立了7個Watermelon模型，用臨床相關(guān)的激酶抑制劑(osimertinib、rapatinib或dradfenib)處理細(xì)胞10天，并對這些細(xì)胞進行分類(圖3I)。與之前的報告一致，這些圖譜按細(xì)胞特性分組，而不是按治療分組(圖3J)。在檢測到足夠數(shù)量(大于50個)的循環(huán)持續(xù)性細(xì)胞的五個模型中，有四個模型中持續(xù)性細(xì)胞的脂肪酸代謝(FAM)特征比非循環(huán)的相應(yīng)細(xì)胞高(圖3k)。與PC9細(xì)胞相似，A375黑色素瘤細(xì)胞循環(huán)持續(xù)細(xì)胞與來自同一模型的非循環(huán)細(xì)胞相比，表現(xiàn)出更高的抗氧化反應(yīng)基因和NRF2信號的表達(dá)(圖3L，M)。相反，循環(huán)HT29和HCC827持久細(xì)胞上調(diào)了其中一個，但不是兩個，這些ROS相關(guān)的信號(圖3L，M)。黑色素瘤(A375)和結(jié)直腸癌(HT29)循環(huán)持續(xù)性細(xì)胞的ROS水平也明顯低于同一細(xì)胞系的非循環(huán)細(xì)胞(圖3n)。
EGFR抑制也在體內(nèi)引起了類似的轉(zhuǎn)變，就像在攜帶可誘導(dǎo)突變EGFR(L858R)的TRP53基因敲除小鼠模型中用奧西美替尼治療的微小殘留病(圖4A)一樣。一旦小鼠患上肺腺癌，作者就用奧西美替尼治療它們，直到腫瘤消退穩(wěn)定下來，這表明殘留病灶很小(圖4A)。來自處理和未處理小鼠的樣本的批量RNA測序顯示，雖然處理導(dǎo)致整體細(xì)胞周期和EGFR信號特征的強烈下降，但極小的殘留疾病細(xì)胞上調(diào)了ROS和FAM基因特征的表達(dá)，這與作者的體外發(fā)現(xiàn)(圖4B)一致。FAM和ROS通路信號在從治療初期到殘留病灶再到進展的治療過程中都顯著且逐漸增加(圖4C，D)。ROS和FAM基因表達(dá)的增加與細(xì)胞增殖有關(guān)，并且在循環(huán)細(xì)胞中高于非循環(huán)的持久細(xì)胞(圖4E，F(xiàn))。值得注意的是，在接受治療的樣本中，ROS和FAM signatures的相關(guān)性比未接受治療的樣本更強（圖4G）。為了測試患者對其他致癌激酶抑制劑的反應(yīng)是否有類似的狀態(tài)，作者分析了另外兩種腫瘤類型的整體RNA-seq圖譜：在基線或接受BRAF抑制劑和MEK抑制劑22治療22天后收集的braf驅(qū)動的黑色素瘤；以及在基線治療或拉帕替尼治療2-3周后患者的her2驅(qū)動的乳腺癌（圖4H）。在HER2+乳腺癌中，F(xiàn)AM和ROS信號誘導(dǎo)僅與藥物治療相關(guān)（圖4I）。
本文小結(jié)：
總而言之，作者的結(jié)果說明了一種方法，不僅可以理解持久者循環(huán)能力的基礎(chǔ)是什么，而且還可以了解是什么驅(qū)動了其他臨床上重要的持久性特征，如復(fù)發(fā)時間，從而為開發(fā)延緩疾病復(fù)發(fā)的治療方法邁出了重要的一步。
