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隨著高通量技術(shù)的廣泛應(yīng)用多組學(xué)整合分析應(yīng)運而生，使得生物學(xué)發(fā)生了革命性的變化，促進了我們對生物過程和分子機制的深刻理解。今天小編給大家介紹的文章題目為Epigenetically regulated lncRNAs dissect the intratumoural heterogeneity and facilitate immune evasion of glioblastomas，是今年3月發(fā)表在Theranostics(if:11.600)上的整合了成對的膠質(zhì)母細胞瘤甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，揭示了膠質(zhì)母細胞瘤中DNA甲基化、IncRNA和免疫調(diào)控之間的相互作用的文章，快來一起看看吧。
一、背景
膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤，其腫瘤微環(huán)境(TIME)高度異質(zhì)性。長鏈非編碼RNA (lncRNAs)的表達可以通過DNA甲基化修飾，其在免疫系統(tǒng)中也逐漸成為重要的調(diào)節(jié)因子。然而，關(guān)于lncRNA的表觀遺傳變化及其對膠質(zhì)瘤免疫異質(zhì)性的貢獻的知識仍然缺乏。在這項研究中，作者整合了成對的膠質(zhì)母細胞瘤甲基組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，并基于lncRNA甲基化特征鑒定了2種免疫亞型并比較膠質(zhì)瘤不同亞型的免疫特性。此外，還鑒定了免疫相關(guān)的lncRNA，并評估了它們與免疫逃避的關(guān)系。
二、結(jié)果
1. lncRNA甲基化異質(zhì)性揭示膠質(zhì)瘤免疫表型
首先作者從TCGA隊列中選擇了551名同時具有DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組譜的膠質(zhì)瘤患者來研究lncRNA甲基化異質(zhì)性的程度。通過對可變DNA甲基化的lncRNA的一致性聚類，將癌癥患者分型為2個最優(yōu)簇(C1和C2)并構(gòu)建了tSNE嵌入聚類來可視化具有l(wèi)ncRNA甲基化特征的聚類，其中C1和C2在兩個維度上分開(圖1A)，C1組患者既有多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)患者，也有低級別膠質(zhì)瘤(LGG)患者，C2組則主要由LGG患者組成。接下來，為了研究lncRNA甲基化模式的差異是否暗示腫瘤間免疫異質(zhì)性和微環(huán)境，作者重點研究了源自ImmPort數(shù)據(jù)庫的17條免疫相關(guān)通路。DEG分析結(jié)果顯示，除了TFG-β家族成員和B細胞抗原受體通路外，大部分免疫通路基因在膠質(zhì)瘤簇之間表現(xiàn)出表達失調(diào)(圖1B)?；诨虮磉_的ssGSEA，C1簇中其他免疫通路的活性顯著升高(圖1B)。此外，作者還估計了膠質(zhì)瘤患者的抗腫瘤免疫活性評分，包括CYT， MHC和ESTIMATE評分。C1組三種免疫活性評分均顯著升高，說明C1組患者具有更強的腫瘤殺傷活性、更強的抗原呈遞能力和更低的腫瘤純度(圖1C)。同時C1簇表現(xiàn)出更高的免疫特征活性(圖1D)。最后，作者使用TIMER評估膠質(zhì)瘤患者免疫細胞的相對比例。在B、CD8+T、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤水平在C1簇中顯著升高(圖1E)。
在本章節(jié)中基于以上結(jié)果，作者認為C1集群屬于免疫“Hot”表型，而C2集群屬于免疫“Cold”表型。并且發(fā)現(xiàn)多個免疫細胞的標記基因在簇之間表現(xiàn)出不同的DNA甲基化模式，C1患者表現(xiàn)為低甲基化，C2患者表現(xiàn)為高甲基化(圖1F)。
圖1 通過lncRNA甲基化研究膠質(zhì)瘤的腫瘤免疫表型特征。
2. 膠質(zhì)瘤免疫表型具有獨特的臨床和表觀遺傳學(xué)特征
在本章節(jié)作者根據(jù)幾個基本的分子和臨床特征進行了免疫亞型的比較分析。在基本的分子特征中發(fā)現(xiàn)ATRX以及TERT突變狀態(tài)、MGMT啟動子甲基化狀態(tài)、1p/19q編碼狀態(tài)、IDH突變狀態(tài)、WHO分級、組織學(xué)診斷和患者年齡呈現(xiàn)不對稱分布(圖2A)。通過比較生存率，作者發(fā)現(xiàn)C1患者的預(yù)后比C2患者差(圖2B)。通過計算編碼區(qū)TMB(每個樣本的總突變數(shù)/ 40Mb)和染色體非整倍性，作者觀察到C1集群中這兩個特征的總體水平較高(圖2C和2D)。然后，作者除遺傳變異外，還探討了表觀遺傳變異。彌漫性膠質(zhì)瘤在TCGA隊列中根據(jù)DNA甲基化被分為6個不同的簇(LGm1-LGm6)。作者發(fā)現(xiàn)C1集群富集LGm4-6的全基因組低甲基化，而LGm1-3富集在C2集群(圖2E)。同時C1中l(wèi)ncRNA的DNA低甲基化水平明顯高于C2集群(圖2F)。接下來，作者使用18狀態(tài)路線圖表觀基因組ChromHMM模型比較膠質(zhì)瘤簇之間的DNA甲基化水平。通過BEDTools將450K探針標注為18種染色質(zhì)狀態(tài)，并在Roadmap中計算每種腦樣品的平均甲基化水平，作者發(fā)現(xiàn)活性TSS狀態(tài)(E01-04)、二價TSS和增強子狀態(tài)(E14-15)表現(xiàn)出相對低甲基化，而轉(zhuǎn)錄(E05-06)、抑制(E12-13、E16-17)和非功能(E18)狀態(tài)則有較高的甲基化(圖2G)，C1組患者在所有18種染色質(zhì)狀態(tài)下的甲基化水平都低于C2組。共有119個CRs被鑒定為不同表達(圖2H)，其中大多數(shù)APOBEC家族被發(fā)現(xiàn)在C1簇中上調(diào)和共表達(圖2I)。
圖2 膠質(zhì)瘤亞型的臨床病理和表觀遺傳學(xué)特征
3. 表觀遺傳調(diào)控的lncRNA與癌癥過程有關(guān)
作者結(jié)合表達和甲基化數(shù)據(jù)來鑒定膠質(zhì)瘤患者中表觀遺傳調(diào)控的lncRNA，發(fā)現(xiàn)了149個ER lncRNA的表達與啟動子DNA甲基化水平呈負相關(guān)(圖3A)。這些ER lncRNA在C1和C2簇之間也具有不同的DNA甲基化水平。大多數(shù)ER lncRNA(144/149)在啟動子區(qū)域顯示低甲基化，與C2組相比，C1組患者的表達增加。值得注意的是，所有ER lncRNA的甲基化都可以根據(jù)其DNA甲基化水平預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后(圖3A)。接下來，作者使用位于ER lncRNA啟動子區(qū)域的最多1000個低甲基化探針進行eForge分析。CpG位點與路線圖腦樣品的激活TSS染色質(zhì)狀態(tài)(即E1激活TSS)和與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的組蛋白修飾(即H3K4me1)相關(guān)(圖3B)，這進一步證明了lncRNAs通過DNA甲基化激活表達。為了探索ER lncRNA的潛在生物學(xué)功能，作者將這些lncRNA分配到離它們最近的蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)上，并進行了共表達分析。大約70%的lncRNAPCG對的表達水平顯著相關(guān)(圖3C)。功能富集分析顯示，ER lncRNAs調(diào)控的PCGs在免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中顯著富集(圖3D)。
圖3 表觀遺傳調(diào)控的lncRNA與膠質(zhì)瘤的發(fā)展相關(guān)
4. 與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控lncRNA
在本節(jié)中作者評估了每組膠質(zhì)瘤患者中ER lncRNA的甲基化/表達水平與免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性。作者保留了表達和甲基化方向相反關(guān)系的基因?qū)?，總共鑒定出66 ~ 130個與浸潤免疫細胞在甲基組和轉(zhuǎn)錄組水平上顯著相關(guān)的lncRNA(圖4A)。在表達水平上，正相關(guān)lncRNA的數(shù)量高于負相關(guān)lncRNA的數(shù)量。其中有39個lncRNA與所有6個免疫細胞浸潤相關(guān)(圖4B)。作者還發(fā)現(xiàn)免疫細胞浸潤受到幾乎ER lncRNA的正調(diào)控，只有ASIC4-AS1表現(xiàn)為負相關(guān)(圖4C)。為了進一步研究ER lncRNA的免疫調(diào)控作用，作者挑選了一個熱門的免疫相關(guān)lncRNA PVT1，發(fā)現(xiàn)PVT1低甲基化，從而在C1膠質(zhì)瘤患者中表達升高(圖4D)。在PVT1高表達和免疫細胞浸潤的細胞簇中，PD-L1作為下游靶點與MYC呈正相關(guān)(圖4E)。這些結(jié)果與PD-L1參與T細胞和巨噬細胞的募集并修飾TIME的觀察結(jié)果一致。接下來，作者估計了ER lncRNA與17種免疫途徑的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)與免疫通路相關(guān)的ER lncRNA在膠質(zhì)瘤簇間的分布是不同的(圖4F)。在與膠質(zhì)瘤中所有浸潤性免疫細胞相關(guān)的39個ER lncRNA中有29個lncRNA參與免疫通路的調(diào)控。與免疫細胞浸潤一致，大多數(shù)lncRNA與免疫通路呈正相關(guān)(圖4G)。
圖4 參與免疫調(diào)節(jié)的表觀遺傳調(diào)控lncRNA
5. 與膠質(zhì)瘤免疫逃避相關(guān)的ER lncRNA
C1組的特征是免疫“Hot”表型，但該組患者的預(yù)后比C2組患者差。為了探索這種矛盾現(xiàn)象的可能原因，作者根據(jù)PCGs在膠質(zhì)瘤簇之間表達的折疊變化對其進行排序，并進行GSEA功能分析。除了免疫調(diào)節(jié)過程外，C1簇中還富集了多個免疫抑制基因集，而C2簇中富集了腦發(fā)育過程和組蛋白修飾(圖5A)。作者通過TIDE分析發(fā)現(xiàn)C1組患者的免疫治療療效低于C2組(圖5B)。此外，C1組患者的TIDE評分、KLRB1表達和Tregs浸潤均顯著升高，這表示C1組患者可能發(fā)生了免疫逃避(圖5B)。作者進一步估計了它們在膠質(zhì)瘤簇之間的表達和甲基化水平。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)免疫逃逸標記是低甲基化的，因此在C1簇中上調(diào)(圖5C)，廣泛的低甲基化引發(fā)GBM細胞的免疫逃逸程序。接下來為了研究ER lncRNA與膠質(zhì)瘤免疫逃避之間的關(guān)系，作者對與免疫細胞浸潤和免疫途徑相關(guān)的29種免疫相關(guān)lncRNA與免疫抑制標志物的表達進行了Pearson相關(guān)分析。在膠質(zhì)瘤患者中觀察到整體正相關(guān)(圖5D)。通過分析抗PD1治療膠質(zhì)瘤的數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)在免疫治療應(yīng)答的患者中，AC131097.3、AL590428.1(CD109-AS1)、LINC02447和LINC01765的表達顯著降低(圖5E)，這些ER lncRNA的表達水平與其啟動子甲基化呈負相關(guān)(圖5F)，ER lncRNA甲基化比表達數(shù)據(jù)更能預(yù)測預(yù)后(圖5G)。
圖5 鑒定ER lncRNA可作為新的免疫逃避標記
6. 體外實驗驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)lncRNA與免疫逃避之間的關(guān)聯(lián)
這一章節(jié)作者在體外實驗中驗證了ER lncRNA作為膠質(zhì)瘤新型免疫逃避標記物的能力。首先通過qRT-PCR檢測了4種ER lncRNAs (AC131097.3、CD109-AS1、LINC02447和LINC01765)在2個GBM細胞系(U251和U87)中的表達水平，發(fā)現(xiàn)CD109-AS1和LINC02447在2個細胞系中均高表達，而AC131097.3和LINC01765則出現(xiàn)缺失(圖6A)。因此，作者利用siRNA技術(shù)在U251細胞系中敲低CD109-AS1和LINC02447，并測量lncRNA的表達。作者發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染的親本細胞相比，siRNA顯著降低了lncRNAs的表達，表明慢病毒傳遞的siRNA序列有效(圖6B)。接下來，作者通過CCK8研究CD109-AS1和LINC02447對GBM細胞活力的影響。發(fā)現(xiàn)ER lncRNA的沉默延緩了U251細胞系的增殖(圖6C)。此外，ER lncRNAs (CD109-AS1和LINC02447)的敲低在蛋白水平上顯著抑制了眾所周知的免疫逃避標記，包括PD-L1、CTLA4和FOXP3(圖6D)。作者采用傷口愈合和transwell實驗來探討ER lncRNA沉默后是否影響細胞遷移和侵襲，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲低ER lncRNAs顯著降低了細胞的遷移和侵襲。(圖6E、6F)。綜上所述，這些結(jié)果表明CD109-AS1和LINC02447顯著促進膠質(zhì)瘤細胞的體外遷移、侵襲、增殖，并與免疫逃避有關(guān)。
圖6 CD109-AS1在GBM細胞系增殖、遷移、侵襲和免疫逃避中的作用
到這里這篇文章小編就介紹完了，本文結(jié)構(gòu)清晰，邏輯嚴謹，在這項研究中，首先作者使用配對lncRNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出膠質(zhì)母細胞瘤亞型具有不同的免疫景觀，這在免疫途徑、免疫活性、特征和時間上都有顯著的反映。然后作者同時考慮了膠質(zhì)瘤亞型之間lncRNA的表達和甲基化水平的變化，鑒定出149個ER lncRNA，ER lncRNA與膠質(zhì)瘤患者的生存相關(guān)，也發(fā)現(xiàn)了lncRNA在膠質(zhì)母細胞瘤免疫相關(guān)亞型之間受DNA甲基化調(diào)節(jié)。接下來作者發(fā)現(xiàn)近29種重要的ER lncRNA與免疫逃避標記物的表達相關(guān)，其中CD109-AS1和LINC02447在免疫抑制中的潛在作用均在抗PD1治療和體外實驗中得到驗證，為膠質(zhì)瘤免疫治療提供了新的靶點。
綜上所述，本研究基于lncRNA甲基化系統(tǒng)地表征了膠質(zhì)瘤患者的免疫亞型，并描述了DNA甲基化、lncRNA和免疫調(diào)節(jié)之間的串擾。通過生物信息學(xué)分析和實驗驗證，首次發(fā)現(xiàn)并驗證了CD109-AS1和LINC02447兩個參與免疫逃避的lncRNA生物標志物，這將促進膠質(zhì)母細胞瘤免疫治療靶點的開發(fā)。
