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空間組織制備的臨床挑戰(zhàn)
空間轉錄組學的相關研究是生物醫(yī)學領域近來的熱點所在，是時空分子圖像的重要組成部分，也是連接分子信息與臨床圖像的橋梁。但在空間組織的制備過程中存在諸多挑戰(zhàn)，今天小編給介紹一篇由復旦大學附屬中山醫(yī)院臨床科學研究所與華大基因研究院等多家機構聯(lián)合發(fā)表在《Clinical and Translational Medicine》,IF=11.492的下面這篇文章。
摘要
目前，時空組學臨床應用存在的挑戰(zhàn)是對空間轉錄組的價值和意義、臨床組織的制備及其數(shù)據(jù)分析和指征缺乏足夠的理解。該研究利用Stereo-seq技術，系統(tǒng)地測試并分析了臨床樣本從獲取到測序環(huán)節(jié)中各關鍵步驟對時空組學數(shù)據(jù)產出和分析結果的影響。這些關鍵步驟，包括樣本選擇、手術方式、樣本收集、保存、運輸、加工、儲存、質控和測序環(huán)節(jié)等。
研究數(shù)據(jù)
研究者收集到肺癌組織、正常組織57對共125份樣本，包括非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)、肉瘤樣癌以及各自混合成分的腫瘤。NSCLC又分為肺腺癌(LUAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)和大細胞癌。在分析研究階段收集了33對組織共77個樣本，驗證研究階段收集了24對組織共48個樣本。
研究方法
整個研究從手術室采集樣本到轉錄組印跡流程見圖1。包括對不同條件下收集到的樣本進行組織學評分、RNA完整性評分和Stereo-seq測序，并對評分結果進行統(tǒng)計分析。
研究成果
1. 樣本H&E染色和RIN值評分
研究人員統(tǒng)計了患者的病理特征，包括年齡、性別、癌癥家族史、既往癌癥史、吸煙史、病理型、T分類、淋巴轉移階段和腫瘤淋巴結轉移（TNM）階段。隨后，研究人員將不同病理特征的組織進行H&E和RIN值評分（表1，圖2）。將HE分為兩組（<90、≥ 90），RIN分為三組（< 6、= 6~7和> 7）。發(fā)現(xiàn)這些臨床現(xiàn)象與RIN或HE評分沒有顯著相關性。
2.空間轉錄組樣本制備
該過程是制備高質量樣本的關鍵，研究人員確定了樣本制備及儲存的多個關鍵環(huán)節(jié)和條件：組織類型、取樣方式、手術室保存時間、運輸條件、樣本前處理方式、包埋方式、-80℃下存儲天數(shù)（圖3）。
3. H&E染色評分、RIN值評分與制備步驟的關系
研究者將H&E染色評分、RIN值評分與樣本制備過程的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)正常組織和腫瘤組織之間的HE評分、RIN評分(圖4A,4C)以及癌旁組織和腫瘤組織之間的RIN值評分存在顯著差，而癌旁組織和腫瘤組織之間的HE評分(圖4B)則沒有顯著差異。
濕處理組織的H&E評分和RIN值評分水平顯著低于干處理組織（圖4E、4F）；離體時間超過30 min的組織的H&E評分低于≤30 min的組織的評分，但二者的RIN值評分沒有顯著差異（圖4G、4H）。液氮中干組織和OCT浸潤組織的H&E評分和RIN值評分，高于液氮中的濕組織（圖4I、4J）。在-80℃下儲存>7 d的組織中的H&E評分低于儲存≤ 7 d，而RIN評分不存在此現(xiàn)象（圖4K、4L）。H&E評分和RIN值評分的相關系數(shù)為0.63，具有顯著性（圖4M）。
綜上所述，通過對不同樣本的H&E和RIN值評分的統(tǒng)計結果進行分析，可以發(fā)現(xiàn)，不同的處理方案之間存在差異。所以，僅通過傳統(tǒng)的質控方案，無法精準地對樣本進行質量評估，需進一步探索結合所產出空間轉錄組學數(shù)據(jù)質控反饋，來明確樣本制備的質控標準。
4. Stereo-seq測序結果與樣本制備的關系
為了進一步揭示不同變量與Stereo-seq的數(shù)據(jù)質量之間的關系，研究人員提出了bin 50-UMI/飽和度/測序總讀數(shù)（BUSSTR）概念。BUSSTR代表RNA捕獲效率，依據(jù)Bin50捕獲量、飽和度和測序結果顯示腫瘤樣本BUSSTR水平顯著高于正常樣本（圖5B），干樣本BUSSTR高于濕樣本(圖5D)，隔離時間≤30 min的樣本BUSSTR高于>30 min的樣本(圖5E)。氣管鏡檢查和手術方法之間(圖5C), - 80?C≤7d和>7d的保存天數(shù) (圖5G)，以及液氮和OCT浸泡干燥組織和濕組織的保存條件之間沒有顯著性差異(圖5F)。RIN和HE評分與UMI這幾件無顯著性差異(圖5 H和I)，RIN < 6、RIN = 6 ~ 7或RIN > 7三組進行差異分析，發(fā)現(xiàn)與UMI之間也無顯著性差異（圖5J）。
5.不同制備步驟的Stereo-seq數(shù)據(jù)質控結果的比較
研究人員對不同制備條件下的Stereo-seq數(shù)據(jù)控制結果進行進行了比較（圖6）。展示了在Bin50范圍內，UMI和空間轉錄組捕獲的基因數(shù)量(圖6A-D)。HE染色與空間轉錄組結果duiy2(圖E-H)，在bin 50分辨率下用Stereo-seq從兩個樣本中捕獲的UMI數(shù)量的空間可視化（圖I-L）、不同樣本截面的無監(jiān)督空間約束聚類（圖M-P）以及UMAP投影（圖Q-T）,發(fā)現(xiàn)滿足“樣本離體小于30 min內處理”和“干燥處理條件”的組織，捕獲基因數(shù)和UMI數(shù)更高，降維聚類效果更好，可以滿足后續(xù)的分析要求。
總結
臨床樣本的處理和存儲條件，會對時空組學數(shù)據(jù)質量產生較大影響。在該研究中通過將不同樣本處理條件與組織學評分、RIN值評分和Stereo-seq測序結果進行關聯(lián)分析，明確了影響最終測序質量的手術室保存時間和樣本處理這兩個關鍵因素，并給出具體操作建議：樣本離體后30 min內盡快進行處理、對樣本進行干燥處理。這樣臨床組織樣本制備成功率和時空組學數(shù)據(jù)的質量都將提高，為時空組學開展基礎研究和臨床轉化醫(yī)學提供借鑒。
