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Spatially resolved multi-omics deciphers bidirectional tumor-host interdependence in glioblastoma
空間多組學(xué)解析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中腫瘤-宿主的相互依賴性
一．研究背景
高級(jí)別和低級(jí)別膠質(zhì)瘤的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）研究表明，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)可塑性是惡性腦腫瘤的標(biāo)志。這種動(dòng)態(tài)適應(yīng)發(fā)生在四種不同的狀態(tài)中，即間充質(zhì)樣（MES樣）、神經(jīng)祖細(xì)胞樣（NPC樣）、星形膠質(zhì)細(xì)胞樣（AC樣）和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞樣（OPC樣）狀態(tài)。盡管腦腫瘤呈現(xiàn)出與健康大腦相似的轉(zhuǎn)錄適應(yīng)和進(jìn)化，但它們長(zhǎng)期以來(lái)一直作為一個(gè)獨(dú)立實(shí)體進(jìn)行研究，忽略了局部微環(huán)境在腫瘤發(fā)生中的作用。然而，最近的文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)元環(huán)境的局部相互作用，其中神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞對(duì)復(fù)雜且動(dòng)態(tài)異質(zhì)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤網(wǎng)絡(luò)有貢獻(xiàn)。由于空間組織信息的丟失，單細(xì)胞分析僅提供細(xì)胞相互作用的間接推斷。在大腦中，空間組織和功能密切相關(guān)。因此，研究者假設(shè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤在功能和空間上也是有組織的?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)（stRNA-seq）是一項(xiàng)新技術(shù)，它允許在原位表征細(xì)胞相互作用和組織，從而破譯惡性腦腫瘤的生態(tài)系統(tǒng)。鑒于scRNA-seq和stRNA-seq具有互補(bǔ)性，兩種技術(shù)的整合至關(guān)重要。細(xì)胞通訊和代謝是對(duì)腦癌動(dòng)態(tài)適應(yīng)具有決定性影響的兩個(gè)關(guān)鍵因素，促進(jìn)生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和治療耐藥。這些代謝改變可歸因于腫瘤代謝的微環(huán)境或區(qū)域異質(zhì)性。例如，已經(jīng)證明，缺氧導(dǎo)致的強(qiáng)制代謝惡化顯著驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄適應(yīng)和基因組不穩(wěn)定性。腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間的細(xì)胞相互作用也越來(lái)越受到關(guān)注，最近的一項(xiàng)研究證明，表觀遺傳免疫編輯驅(qū)動(dòng)獲得性免疫入侵程序，導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中出現(xiàn)的空間異質(zhì)性景觀。這些研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，需要在空間分辨的背景下，全面研究膠質(zhì)瘤由于微環(huán)境而產(chǎn)生的各種轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性。該研究旨在提供膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與其局部微環(huán)境的空間分辨轉(zhuǎn)錄程序和細(xì)胞相互作用圖譜。
二．研究方法
研究者通過(guò)空間分辨的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)表征膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，確定以免疫和代謝應(yīng)激因素為標(biāo)志的微環(huán)境，揭示了局部區(qū)域腫瘤-宿主的相互依賴性，從而導(dǎo)致空間特定適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄程序的產(chǎn)生。此外，他們將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞模型植入人類和嚙齒動(dòng)物新皮質(zhì)組織模擬各種環(huán)境，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄狀態(tài)源于對(duì)各種環(huán)境的動(dòng)態(tài)適應(yīng)。
三．研究結(jié)果
1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的空間分辨轉(zhuǎn)錄組圖譜
為了表征GBM的空間結(jié)構(gòu)，研究者產(chǎn)生了28個(gè)樣本的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（stRNA-seq）圖譜，共產(chǎn)生了88,793個(gè)spots。研究者還補(bǔ)充了來(lái)自組織的空間代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)（用于stRNA-seq輔助整合分析（圖1A）。基于相互最近鄰（MNN）的水平整合和共享最近鄰（SNN）聚類顯示，非惡性樣本在患者之間表現(xiàn)出相似性。惡性樣本以獨(dú)特的基因表達(dá)譜為特征，聚類間樣本多樣性的高香農(nóng)熵進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1B）。若惡性起源的樣本顯示出顯著較低的熵，則表明該簇由個(gè)體患者的spots組成（圖1B和1C）。這些發(fā)現(xiàn)與最近的單細(xì)胞研究一致，即大量個(gè)體拷貝數(shù)改變和突變譜有助于患者間的異質(zhì)性，從而導(dǎo)致個(gè)體轉(zhuǎn)錄譜改變。在所有樣本的88,793個(gè)spots中，63,121個(gè)spots來(lái)自惡性樣本，其中46,459個(gè)spots,每個(gè)spot中腫瘤細(xì)胞含量的比例在95%以上（圖1C）。為了研究腫瘤浸潤(rùn)區(qū)域，作者根據(jù)Ivy GAP組織學(xué)分類系統(tǒng)預(yù)測(cè)了spots組織學(xué)表型（圖1D）。與組織病理學(xué)特征相比，具有低腫瘤細(xì)胞頻率的樣本主要包含浸潤(rùn)區(qū)域，在這些區(qū)域中，健康皮質(zhì)內(nèi)很少有腫瘤細(xì)胞的存在（圖1E）。
2.解析空間分辨率的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性
研究者通過(guò)與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄和組織學(xué)分類數(shù)據(jù)聯(lián)系來(lái)重現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄模式。通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)了五個(gè)轉(zhuǎn)錄模式，并且90%的腫瘤中存在這5個(gè)模式（圖2A）。隨后研究者整合了患者空間加權(quán)相關(guān)矩陣，然后是層次聚類，證實(shí)了五個(gè)空間不同轉(zhuǎn)錄模式在空間中是分離的（圖2A）。通過(guò)探索這些不同的程序，研究者確定了兩個(gè)與膠質(zhì)相關(guān)基因（如GFAP、AQP4、VIM、CD44）高表達(dá)相關(guān)的空間不同的轉(zhuǎn)錄模式。雖然這兩個(gè)模式都顯示了神經(jīng)膠質(zhì)譜系，但其中一個(gè)與放射狀神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)基因（如HOPX、PTPRZ1）表達(dá)增加相關(guān)，稱為“Radial Glia”；另一個(gè)顯示了炎癥相關(guān)基因（如HLA-DRA、C3）和INF-γ通路的功能富集，稱為“Reactive Immune”（圖2A）。其余的轉(zhuǎn)錄模式顯示出與神經(jīng)膠質(zhì)譜系一致，并根據(jù)其神經(jīng)稱為“Neuronal Development”或者少突膠質(zhì)細(xì)胞起源以“Spatial OPC”命名（圖2C）。第五個(gè)轉(zhuǎn)錄模式，進(jìn)一步稱為“Reactive Hypoxia”，該模式與缺氧反應(yīng)（如VEGFR、HMOX1、GAPDH）和糖酵解（如LDHA、PGK1）基因相關(guān)，表明與低濃度氧結(jié)合的代謝改變?cè)谀承﹨^(qū)域驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄上不同的狀態(tài)（圖2A、2B）。
3.不同的空間轉(zhuǎn)錄模式獨(dú)立于細(xì)胞周期
為了確定檢測(cè)到的不同的空間轉(zhuǎn)錄模式是否存在于所有細(xì)胞周期階段，研究者根據(jù)其轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期程序?qū)λ衧pots進(jìn)行分類。轉(zhuǎn)錄模式均勻分布在所有細(xì)胞周期階段（圖2A）。為了進(jìn)一步將發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有分類系統(tǒng)相結(jié)合，對(duì)已有的bulkRNA-seq、scRNA-seq和stRNA-seq上不同的轉(zhuǎn)錄模式分類進(jìn)行了空間加權(quán)回歸，以映射空間關(guān)系（圖2C）。利用Neftel等人的scRNAseq數(shù)據(jù)集對(duì)不同空間轉(zhuǎn)錄模式得分最高的基因特征進(jìn)行整合，證實(shí)Radial Glia、Spatial OPC和Neuronal Development三個(gè)轉(zhuǎn)錄模式分別與AC-like、OPC-like和NPC-like具有很大的重疊。與Richards等人的數(shù)據(jù)相比，上述所有模式均與神經(jīng)發(fā)育表型具有大部分重疊（圖2C）。Reactive Hypoxia模式與MES-like亞型具有很大部分重疊，特別是缺氧依賴性“MES2”狀態(tài)（圖2C）。
4.不同的空間轉(zhuǎn)錄模式和亞克隆結(jié)構(gòu)
拷貝數(shù)改變（CNA），包括癌基因的局灶性擴(kuò)增或腫瘤抑制因子的丟失，是惡性細(xì)胞的標(biāo)志，據(jù)報(bào)道，這些細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致治療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)。在已知的細(xì)胞狀態(tài)分類中，獨(dú)特的CNA與特定狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，但在單個(gè)腫瘤細(xì)胞中分布不均勻。在Reactive Hypoxia相關(guān)spots中，研究者發(fā)現(xiàn)CNA的顯著累積作為獨(dú)立的亞克隆事件發(fā)生（圖2D）。接下來(lái)，作者研究空間上不同的轉(zhuǎn)錄多樣性是否可以直接反映腫瘤內(nèi)亞克隆。他們通過(guò)患者特異性的CNA進(jìn)行層次聚類重建克隆結(jié)構(gòu)。共鑒定出57個(gè)亞克隆，每個(gè)樣本含有2至6個(gè)亞克隆不等（圖3A）。然后，確定了每個(gè)亞克隆中樣本、不同的空間轉(zhuǎn)錄模式的分布（圖3B和3C）。分析表明，在26.32%的亞克隆中，單一轉(zhuǎn)錄模式占主導(dǎo)地位（每個(gè)亞克隆的spots數(shù)超過(guò)75%）。這些結(jié)果表明克隆結(jié)構(gòu)對(duì)不同空間轉(zhuǎn)錄模式的發(fā)生影響不大，盡管亞克隆偶爾偏向Spatial OPC（8.77%）或Reactive Hypoxia模式（10.52%）（圖3D）。
5.與Reactive Hypoxia模式相關(guān)的代謝改變
為了進(jìn)一步探索空間上不同的Reactive Hypoxia模式，研究者進(jìn)行空間代謝組學(xué)研究（圖4A）。進(jìn)一步分析識(shí)別出三個(gè)顯著的代謝亞組（圖4A、4B）。功能代謝分析顯示第一個(gè)代謝模塊（M-G1）中磷酸戊糖途徑顯著富集。第二個(gè)代謝模塊（M-G2）的特征是磷酸腺苷酸代謝的富集。第三個(gè)代謝模塊（M-G3）在糖酵解和氨基糖代謝顯著富集（圖4C）。
6.Reactive Hypoxia模式積累染色體改變
由于缺氧已被證明會(huì)導(dǎo)致DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)基因的表達(dá)改變，從而抑制重組介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)，增加突變率和CNA。為了研究假設(shè)，探索了Reactive Hypoxia通路富集的區(qū)域，該區(qū)域還富集糖酵解途徑（圖4D）。并且CNA圖譜顯示，在缺氧核心區(qū)，染色體15p、14q和7p/q顯著缺失。個(gè)別樣本在多條染色體（8p、9p、13q、19q和21q）上也顯示出的丟失和擴(kuò)增，這種變異最有可能由缺氧核心區(qū)域內(nèi)的單個(gè)亞克隆造成，這證明了缺氧相關(guān)代謝是一種潛在的基因組不穩(wěn)定性的驅(qū)動(dòng)因素（圖4E）。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證該發(fā)現(xiàn)，研究者分析了TCGA-GBM樣本（GBM IDH1/2野生型n=357），根據(jù)患者的缺氧基因表達(dá)評(píng)分對(duì)其進(jìn)行分類（圖5A和5B）。缺氧驅(qū)動(dòng)的腫瘤顯示染色體改變顯著增加，證實(shí)了代謝與基因組不穩(wěn)定性之間的關(guān)系（圖5C和5D）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)了原代患者來(lái)源的GBM細(xì)胞系2-6周（圖5E）。在慢性缺氧條件下CNA事件的顯著累積證實(shí)了應(yīng)激誘導(dǎo)CNA變異的假設(shè)（圖4E）。此外，研究者通過(guò)分析常氧和缺氧條件下CpG位點(diǎn)cg12434587和cg12981137處的O-6甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）啟動(dòng)子甲基化，研究了缺氧代謝對(duì)DNA甲基化的影響。在常氧條件下具有非甲基化MGMT啟動(dòng)子的細(xì)胞系在缺氧條件下會(huì)發(fā)生高甲基化（圖5F）。
7.缺氧代謝調(diào)節(jié)GBM中的“go or grow”潛能
有文獻(xiàn)報(bào)道表明缺氧應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞周期停滯，特別是S期停滯（圖6A）。根據(jù)研究模型，觀察到了缺氧代謝和細(xì)胞遷移之間的反向關(guān)系（圖6B、6C和6D）?？傊麄兊陌l(fā)現(xiàn)為代謝變化和氧化應(yīng)激是基因組多樣性的潛在相互驅(qū)動(dòng)因素提供了證據(jù)，從而導(dǎo)致GBM的克隆進(jìn)化。
當(dāng)缺氧發(fā)生時(shí)，這種低氧誘導(dǎo)的糖酵解轉(zhuǎn)變會(huì)導(dǎo)致go programs的誘導(dǎo)，這有助于細(xì)胞逃逸/遷移到常氧區(qū)。由于在缺氧條件下，會(huì)發(fā)生S期停滯，隨后會(huì)導(dǎo)致從頭CNA的積累。作者假設(shè)這些受缺氧影響的細(xì)胞中有很大一部分會(huì)進(jìn)入凋亡狀態(tài)，導(dǎo)致在GBM中看到的特征性壞死。只有一小部分細(xì)胞通過(guò)遷移相關(guān)轉(zhuǎn)錄模式的上調(diào)成功逃脫。除缺氧外，據(jù)報(bào)道，其他壓力源（如放射或化療）會(huì)導(dǎo)致GBM出現(xiàn)這種與壓力相關(guān)的擾動(dòng)（圖6A）。
根據(jù)這個(gè)模型，可以看到低氧代謝和細(xì)胞遷移之間的反比關(guān)系。為了探索代謝改變區(qū)域中遷移基因表達(dá)特征的富集，研究者確定了特定基因表達(dá)特征的低富集和高富集之間的定向梯度的空間方向。每個(gè)點(diǎn)的方向向量是基于其局部鄰域中所研究的基因表達(dá)特征的分級(jí)富集。這些向量場(chǎng)計(jì)算使作者能夠近似空間基因表達(dá)軌跡，從而能夠識(shí)別空間上相反的轉(zhuǎn)錄途徑（圖6B）。基于這些矢量場(chǎng)計(jì)算，研究者報(bào)告缺氧響應(yīng)和遷移特征顯示反向空間軌跡（圖6C和6D）。
8.探索Reactive Immune區(qū)域的腫瘤-宿主相互依賴性
研究者空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在Reactive Immune的區(qū)域中，髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞顯著增加（圖7A、7B和7C）。為了研究Reactive Immune區(qū)域的腫瘤細(xì)胞分化，研究者通過(guò)將細(xì)胞細(xì)分為Radial Glia（EGFR+HOPX+）、Reactive Immune（EGFR+CHI3L1+VIM+）、Spatial OPC（EGFR+OLIG1+）、Neuronal Development（EGFR+SNAP25+CALM2+）和Reactive Hypoxia（EGFR+）。
研究者根據(jù)腫瘤細(xì)胞與淋巴或髓系細(xì)胞之間的距離量化了它們之間的細(xì)胞連通性，證實(shí)了腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)錄定義的Reactive Immune區(qū)域中的免疫區(qū)室之間增強(qiáng)的細(xì)胞相互作用（圖7D）。接下來(lái)，探討了不同（regions of interest）ROI中細(xì)胞類型的分布。研究者證實(shí)了在Reactive Immune和Reactive Hypoxia中有AC-like和MES-like細(xì)胞富集。OPC-like細(xì)胞主要富集于Neuronal Development中（圖7E和7F）。此外，Reactive Immune和Reactive Hypoxia區(qū)域均顯示腫瘤相關(guān)髓系細(xì)胞（TAM）和T細(xì)胞顯著富集（圖7G）。
鑒于T細(xì)胞在Reactive Immune和Reactive Hypoxia區(qū)域都富集，作者研究了T細(xì)胞（CD3+）上的平均PD-1蛋白水平，與Reactive Hypoxia和Neuronal Development相比，Reactive Immune區(qū)域內(nèi)顯著增加，表明Reactive Immune中的局部免疫抑制增強(qiáng)。此外，GBM的scRNA-seq數(shù)據(jù)集證實(shí)了腫瘤Reactive Immune區(qū)域中記憶和耗竭T細(xì)胞的富集（圖7H）。
9.環(huán)境條件有助于雙向亞型轉(zhuǎn)變
通過(guò)之前建立的基于人體器官型新皮質(zhì)組織的GBM模型來(lái)模擬了組織浸潤(rùn)，該模型沒有代謝和免疫壓力。為了評(píng)估各種微環(huán)境的影響，研究者使用了不同年齡的人類組織和來(lái)自2周小鼠和2歲大鼠的組織（圖8A）。將組織培養(yǎng)4天，然后將類似MES-like原發(fā)性患者衍生細(xì)胞系接種到所有培養(yǎng)的組織切片中（圖8A）。培養(yǎng)7天后，消化組織，并使用FACS分離腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行scRNA-seq分析。使用inferred CNAs分析（圖8C和8D），基于腫瘤細(xì)胞在7號(hào)染色體中的特征性擴(kuò)增對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算鑒定。
為了探索不同宿主環(huán)境的動(dòng)態(tài)適應(yīng)，所有惡性細(xì)胞都根據(jù)其相應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行富集（圖8E和8F）。基線狀態(tài)顯示出MES-1/2-like的表型，轉(zhuǎn)錄多樣性程度低但大多數(shù)處于細(xì)胞周期循環(huán)（圖8E）。在嚙齒動(dòng)物神經(jīng)環(huán)境中培養(yǎng)的GBM細(xì)胞表現(xiàn)出MES-1/2-like和AC-like轉(zhuǎn)錄特征的富集。為了探索動(dòng)態(tài)適應(yīng)，作者進(jìn)行了RNA速率分析（圖8G）。
一般來(lái)說(shuō)，從初始體外細(xì)胞培養(yǎng)（圖8G和8H）到MES-like和AC-like，表示由神經(jīng)環(huán)境驅(qū)動(dòng)的方向自適應(yīng)。PTPRZ1是放射狀膠質(zhì)細(xì)胞分化的GBM細(xì)胞的常見標(biāo)記基因，基于其在MES-AC-hybrid狀態(tài)下的高速率相圖（圖8G、8H和8I），研究者的分析證實(shí)了OPC-like和NPC-like分支內(nèi)的雙向命運(yùn)。
四、總結(jié)
綜上所述，該工作在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中使用空間分辨多組學(xué)，并識(shí)別以免疫和代謝應(yīng)激因子為特征的微環(huán)境。這些空間生態(tài)位受腫瘤微環(huán)境的影響，反映了對(duì)炎癥或代謝刺激的轉(zhuǎn)錄適應(yīng)，并重現(xiàn)了神經(jīng)發(fā)育階段。這篇文章有很多值得我們學(xué)習(xí)的地方，比如在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上，采用了許多先進(jìn)的空間組學(xué)技術(shù)，空間轉(zhuǎn)錄組、空間代謝組以及空間蛋白質(zhì)組；在機(jī)制上，聯(lián)合了體內(nèi)和體外模型，逐步驗(yàn)證潛在的機(jī)制。
