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結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，在結(jié)直腸癌的治療中，基于生物標(biāo)志物檢測(cè)進(jìn)行治療決策已是共識(shí)。今天給大家分享的是一篇關(guān)于結(jié)直腸癌的免疫相關(guān)lncRNA 特征的文章，發(fā)表于《nature communications》（IF: 14.919）上。
基于機(jī)器學(xué)習(xí)的整合開發(fā)了一種用于改善結(jié)直腸癌預(yù)后的免疫相關(guān)lncRNA 特征
研究思路
本研究收集了多個(gè)數(shù)據(jù)集，同時(shí)也結(jié)合了內(nèi)部臨床數(shù)據(jù)集。總體研究思路是算法開發(fā)、模型構(gòu)建、公共數(shù)據(jù)集和內(nèi)部臨床數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證、耐藥性和臨床治療研究?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)的算法開發(fā)是本研究的一大亮點(diǎn)。
結(jié)果
1. 免疫浸潤亞群的鑒定和驗(yàn)證
作者首先通過根據(jù)ssGSEA 評(píng)估的 28 個(gè)免疫細(xì)胞浸潤豐度對(duì)CRC樣本進(jìn)行了共識(shí)聚類，將所有樣本分成C1和C2兩大亞群，C2 的總體浸潤程度明顯高于 C1。然后作者通過 ESTIMATE 算法計(jì)算的 TCGA-CRC 隊(duì)列中兩個(gè)亞群之間的免疫評(píng)分情況，C2也是高于C1，說明了ssGSEA 結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性（圖1A-D）。
2. 鑒定源自免疫浸潤模塊的 lncRNA 模塊
為提取出與免疫相關(guān)的lncRNA，作者進(jìn)一步進(jìn)行了WGCNA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃色模塊與免疫的相關(guān)性最高（圖1F）。于是作者從這一模塊中篩選出了526 個(gè)lncRNA，其篩選標(biāo)準(zhǔn)是GS（Gene Signifificance） > 0.5 和 MM（Module Membership）> 0.6（圖1G）。
3. 根據(jù)ImmLnc算法篩選免疫相關(guān) lncRNA
ImmLnc是一種用于識(shí)別免疫相關(guān)通路的 lncRNA的集成算法，首先是使用 ESTIMATE 算法推斷腫瘤純度，其次通過將腫瘤純度調(diào)整為協(xié)變量，計(jì)算特定lncRNA與所有 mRNA 之間的偏相關(guān)系數(shù) (PCC)，最后，根據(jù)所有的mRNAs與特定lncRNA的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行排序，排序后的基因列表進(jìn)一步進(jìn)行 GSEA 分析。一般lncRES 評(píng)分 >0.995且 FDR?<?0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
根據(jù)ImmLnc算法作者確定了 791 個(gè)免疫相關(guān) lncRNA，它們與細(xì)胞因子受體、TCR 信號(hào)通路、趨化因子受體、NK細(xì)胞毒性和抗原加工和呈遞等通路相關(guān)（圖1H）。再通過與前面 WGCNA鑒定出的lncRNA取交集，共提取了 235個(gè)重疊的 lncRNA 用于后續(xù)分析（圖 1I）。
4. 共識(shí)特征的綜合構(gòu)建
基于前面所鑒定出的235 個(gè)免疫相關(guān) lncRNA 的表達(dá)譜，作者通過單變量Cox分析確定了 43 個(gè)預(yù)后相關(guān)lncRNA。在TCGA-CRC隊(duì)列中，作者通過留一法交叉驗(yàn)證（LOOCV）擬合了 101 種預(yù)測(cè)模型，并進(jìn)一步計(jì)算了每個(gè)模型在所有驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中的C-index。發(fā)現(xiàn)最佳模型是Lasso 和逐步 Cox回歸的組合，該組合模型在所有驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中都具有很高的C-index（圖2A）。然后作者確定了最佳 λ，并進(jìn)一步生成預(yù)后基因的 Lasso 系數(shù)（圖 2B）。作者接著對(duì) Lasso 系數(shù)非零的 30 個(gè) lncRNA 進(jìn)行逐步 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸，最終確定了 16 個(gè) lncRNA（圖 2C），構(gòu)建了免疫相關(guān) lncRNA 特征（IRLS）。之后，作者根據(jù) survminer 包確定的最佳臨界值，將所有患者分為高危組和低危組。如圖 2D-J 所示，在TCGA-CRC 訓(xùn)練數(shù)據(jù)集和六個(gè)驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存期 (OS) 明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組。將所有樣本組合在一起也顯示出相同的趨勢(shì)（圖2K）。
5. IRLS 模型的評(píng)估
為進(jìn)一步評(píng)估IRLS 模型的性能，作者計(jì)算了TCGA-CRC隊(duì)列、GSE17536、GSE17537、GSE29621、GSE38832、GSE39582和GSE72970隊(duì)列以及綜合隊(duì)列中樣本1 年、3 年和 5 年的 AUC（圖3A）。并計(jì)算出了所有數(shù)據(jù)集的 IRLS 的 C-index（圖3B）。之后作者又對(duì)IRLS 在預(yù)測(cè)預(yù)后方面的表現(xiàn)與其他臨床和分子變量進(jìn)行了比較，如圖 3C 所示，IRLS 的準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于其他變量。
6. CRC中基于基因表達(dá)的預(yù)后特征的比較
接下來，作者比較了 IRLS 與其他特征的性能，一共收集了109 個(gè)特征（包括 mRNA 和 lncRNA 特征）。作者對(duì)每個(gè)特征在所有數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了單變量Cox 回歸，觀察到只有IRLS模型與所有隊(duì)列樣本的預(yù)后顯著相關(guān)（圖 4A），這個(gè)結(jié)果證明了IRLS的穩(wěn)定性。此外，作者又將 IRLS與其他特征的C-index進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)IRLS 在每個(gè)數(shù)據(jù)集中都顯示出比幾乎其他所有特征更好的性能（圖4B），這說明了IRLS模型的適用性較廣。
7. 在臨床內(nèi)部隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證
為了進(jìn)一步驗(yàn)證IRLS 模型在臨床的可行性價(jià)值，作者接下來通過 qRT-PCR 分析評(píng)估了這些 lncRNA 在 232 名 CRC 患者的臨床隊(duì)列中的表達(dá)情況。Kaplan-Meier 分析表明，IRLS 高的患者的 OS 和 RFS 顯著降低（圖 5A-B）。在進(jìn)一步的多變量 Cox 回歸分析中，IRLS 模型對(duì)于 OS仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5C-D），與上述結(jié)果一致。接下來的ROC分析也顯示 IRLS 的準(zhǔn)確性更高：預(yù)測(cè) 1、3 和 5 年 OS的AUC 分別為 0.840、0.776 和 0.818（圖5E）。此外，作者還比較了 IRLS 與其他臨床特征的預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)??IRLS 的預(yù)測(cè)性能優(yōu)于其他特征（圖5F）?？偟膩碚f，對(duì)臨床內(nèi)部隊(duì)列的分析結(jié)果驗(yàn)證并證實(shí)了IRLS 模型的穩(wěn)健性，說明其可以作為 CRC 預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。
8. 氟尿嘧啶類ACT和貝伐單抗療效的預(yù)測(cè)價(jià)值
研究表明，lncRNA 與氟尿嘧啶類ACT和貝伐單抗的敏感性和耐藥性有關(guān)。因此，作者進(jìn)一步評(píng)估了IRLS在量化氟尿嘧啶基ACT和貝伐單抗療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。研究中納入了 6 個(gè)使用氟尿嘧啶類ACT治療的數(shù)據(jù)集（GSE19860、GSE28702、GSE45404、GSE69657 、GSE72970和GSE62080），包括 180 名無應(yīng)答者和 160 名應(yīng)答者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)答組的 IRLS 分?jǐn)?shù)顯著高于無應(yīng)答組（圖6A-E）。圖6F的GSE62080 中的應(yīng)答組有更高IRLS 的趨勢(shì)，但這并不顯著。作者推測(cè)這可能是由于樣本量太少。進(jìn)一步的ROC 分析表明，IRLS 可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)氟尿嘧啶類ACT的療效（圖 6G-L）。之后，作者也在內(nèi)部隊(duì)列中進(jìn)行了相同的分析，也得到了同樣的結(jié)論（6M-N）。最后，作者還收集了三個(gè)有貝伐單抗治療信息的數(shù)據(jù)集（GSE19860、GSE19862 和 GSE72970），評(píng)估了IRLS 對(duì)貝伐單抗療效的預(yù)測(cè)，與氟尿嘧啶類ACT 相比，對(duì)貝伐單抗敏感的患者，表現(xiàn)出較低的IRLS水平（圖 6O-Q）。綜合來看，IRLS高的患者往往對(duì)氟尿嘧啶類ACT敏感，對(duì)貝伐單抗耐藥，而IRLS低的患者對(duì)貝伐單抗敏感，對(duì)氟尿嘧啶類ACT耐藥。
9. IRLS 對(duì) ICI 治療的意義
由于IRLS是基于免疫相關(guān)的 lncRNA開發(fā)的，于是作者假設(shè)不同水平的 IRLS 的免疫特征和免疫治療效果存在差異。細(xì)胞浸潤分析顯示 TCGA-CRC 和 Meta-GEO 隊(duì)列中 IRLS 和免疫浸潤豐度之間存在顯著的負(fù)相關(guān)（圖7A-D）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD8A 在不同 IRLS水平下的蛋白質(zhì)表達(dá)，作者對(duì)石蠟切片進(jìn)行了IHC，其中包括56個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)CRC和 48個(gè)低風(fēng)險(xiǎn)CRC樣本。 IHC 圖像和評(píng)分顯示，CD8A的表達(dá)在低風(fēng)險(xiǎn)組中顯著升高（圖7E-F）。這表明 IRLS 低的患者可能擁有更多的ICI（免疫檢查點(diǎn)抑制劑 ）治療后備資源。此外，IRLS 還與 TCGA-CRC、Meta-GEO和內(nèi)部隊(duì)列中的 PD-L1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖7G）。在蛋白質(zhì)水平上也有一致的發(fā)現(xiàn)（圖 7I-J）。此外，微衛(wèi)星狀態(tài)也被認(rèn)為是CRC中免疫浸潤和 ICI 治療的有力的生物標(biāo)志物。在這項(xiàng)研究中，作者觀察到 dMMR/MSI-H患者的IRLS 顯著低于 pMMR/MSI-L/MSS 患者。同時(shí)，IRLS可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè) TCGC-CRC、Meta-GEO和內(nèi)部隊(duì)列中的 dMMR/MSI-H 表型（圖7K-M）。這表明 IRLS 是微衛(wèi)星狀態(tài)標(biāo)記的有利替代物。最后，作者發(fā)現(xiàn)IRLS 還可以顯著區(qū)分pembrolizumab的應(yīng)答者和無應(yīng)答者，并顯著優(yōu)于 PD-L1和 CD8A（圖7N）。
總結(jié)
在本研究中，作者開發(fā)了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的集成算法（ImmLnc），用于構(gòu)建共識(shí)免疫相關(guān) lncRNA 特征 (IRLS)模型。之后又通過評(píng)估IRLS模型在多個(gè)數(shù)據(jù)集中的應(yīng)用性能、比較其他特征與IRLS模型的預(yù)測(cè)性能以及IRLS模型在臨床樣本中的應(yīng)用，綜合說明了IRLS模型的穩(wěn)定性和可靠性。
參考文獻(xiàn)
Liu, Z., Liu, L., Weng, S. et al. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun 13, 816 (2022).
