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大家好，看過許多腫瘤分子分型的文章，今天我們換個角度，從腫瘤相關成纖維細胞的角度去解讀一篇肺癌腫瘤相關成纖維細胞分子分型的文章，2021年10月7日，由美國哈佛大學醫(yī)學院、美國麻省總院癌癥中心的胡海川博士等研究機構合作在《Cancer Cell》上發(fā)表了名為“Three subtypes of lung cancer fifibroblasts defifine
distinct therapeutic paradigms”的文章，這篇文章從腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）的角度創(chuàng)新性的研究出肺癌中的一個新的獨立分子分型，系統(tǒng)的闡述了CAFs在功能水平上的異質性，通過對CAFs的分子分型，全面揭示不同亞型的臨床意義。
文章亮點：
1.來自非小細胞肺癌患者的CAFs生物庫重現了臨床CAF異質性
2.NSCLC CAFs的治療譜揭示了三種不同的功能亞型
3.I型和II型CAFs具有較高的HGF和FGF7表達，對癌細胞有保護作用
4.亞型III 型CAFs與更好的臨床反應和免疫細胞遷移有關
前言：
腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境中最主要的成分之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著必不可少的作用。骨髓和脂肪的局部組織固有成纖維細胞及間充質干細胞是CAFs來源的主要前體細胞。大量研究表明，CAFs并不作為單獨細胞在腫瘤周圍存在，而是和腫瘤細胞相互作用，促進腫瘤的生長與存活并維持其惡性傾向。腫瘤細胞可以影響CAFs前體的招募，并誘導正常成纖維細胞活化為CAFs；同時,CAFs可以分泌多種細胞因子、生長因子和細胞外基質蛋白質，促進腫瘤細胞的增殖、耐藥及侵襲轉移，從而影響腫瘤的預后。CAFs還參與血管淋巴管的生成、細胞外基質重塑、免疫抑制以及腫瘤細胞上皮間質轉化等有利于腫瘤發(fā)生發(fā)展的外源性途徑，為腫瘤細胞提供了一個良好的微環(huán)境。大量研究顯示，研發(fā)靶向CAFs的藥物可以中斷其與腫瘤細胞之間的聯系，從而抑制腫瘤的生長和轉移。因此，深入了解CAFs促腫瘤的作用機制將有利于腫瘤治療新靶點的發(fā)現。
肺癌精準治療發(fā)展史：
靶向治療：
抗血管生成 在一線及二線治療中，使用抗血管內皮生長因子（VEGF) 貝伐單抗或抗血管內皮生長因子受體（VEGFR）雷莫蘆單抗與化療聯合均可以延長總生存期。 貝伐單抗，目前使用僅限于非鱗癌，聯合含鉑雙藥是指南推薦的治療策略。 尼達尼布，既能夠抗 VEGFR 又是多種酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)，它與二線化療方案聯用可以延長非鱗癌患者生存期。
EGFR 突變 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）吉非替尼和厄洛替尼在一小部分患者中的療效獲得了戲劇性的突破。在 EGFR 突變的患者中, 比較三種 EGFR TKIs（吉·非替尼、埃羅替尼或阿法替尼 ) 與以鉑類為基礎的化療治療 NSCLC 的療效。結果見下表： 所有結果表明：EGFR TKIs 戰(zhàn)勝化療成為 EGFR 突變 NSCLC 的一線治療（更高的 ORR、更長的 PFS、更低的毒性、更好的生存質量）。 不幸的是，肺癌仍然不能被治愈，因為所有的肺癌最終還是會發(fā)生腫瘤進展，最常見的原因是突變耐藥。50%～60 耐藥為T790M 位點突變患者，因 T790M 突變對厄洛替尼、吉非替尼耐藥后，第三代 TKIs 奧希替尼可以提高 ORR。因此當一線靶向治療失敗后決定是否使用奧希替尼進行二線治療時, 必須知道患者 T790M 突變情況，如果發(fā)生突變，方可以改用奧希替尼。
ALK 基因突變 ALK 突變的比例在 NSCLC 中約為 3%～5%，克唑替尼是目前治療 ALK 陽性癌癥患者最為有效的藥物，服用前必須做 ALK 基因檢測，對該類型患者 ORR 達到 50% 左右，與化療相比，可獲得更長的 PFS。
其他除 ALK 基因突變外，肺癌患者還可能存在 ROS1、MET、BRAF (V600E)、HER2 、RET 基因突變，目前以上述基因為靶點的藥物尚在臨床試驗中，并未在國內上市，相關藥物及現階段試驗結果見下表：
參考文獻：Karnofsky Award 2016: A Lung Cancer Journey, 1973 to 2016，http://ascopubs.org/doi/full/10.1200/JCO.2016.70.4064.
結果解讀：
建立一個PDF（患者源成纖維細胞）庫，充分捕獲非小細胞肺癌CAF異質性，NSCLC CAF異質性決定TKI治療療效發(fā)現
為了捕獲非小細胞肺癌中CAFs的多樣性用于功能研究，研究人員從含有EGFR突變或ALK融合等靶向致癌驅動因素的非小細胞肺癌的活檢中建立了大量患者源性成纖維細胞(PDF)，首先檢查了非小細胞肺癌中CAFs的表型異質性程度。與不同腫瘤間質的不同病理組織學表現相似（圖a）。pdf在形態(tài)學和生長模式方面表現出相當大的差異（圖c），為了更深入地了解這些模型的多樣性和保真度，研究人員對這些PDF模型中10個CAF標記的表達進行了表達特征分析（圖e），同時還發(fā)現COL1A2或ACTA2 mRNA水平與活檢時患者年齡的相關性強，根據腫瘤活檢部位顯示S100A4或PDGFRA mRNA水平的相關性強（圖f），研究人員分析了來自切除的nsclc的代表性scRNA-seq數據集的1465個成纖維細胞，包括肺腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌中的CAFs 。統(tǒng)一流形近似和投影(UMAP)顯示了7種分子類型，UMAP-1到UMAP-8, UMAP-4由于數據集中單細胞質量較差而被排除在外（圖h），這些分析表明，pdf文件差異表達獨特的UMAP標記基因，并共同概括了臨床NSCLC CAFs的所有七個分子類別(圖i)。這些患者由于接受EGFR和ALK治療后產生了耐藥性，研究人員利用二者的耐藥水平和耐藥機制發(fā)掘CAFs的差異，發(fā)現了HGF-MET和FGF-FGFR通路，得出結論，CAFs主要利用這兩條通路在不同程度上造成的耐藥，可進一步影響藥物的治療，這為后續(xù)精準藥物的研發(fā)奠定了很好的基礎。
NSCLC CAF異質性決定TKI治療療效
在晚期NSCLC中，EGFR的致癌突變和ALK的融合分別存在約20%和5%，為了弄清CAFs是否以及在多大程度上影響對EGFR TKI治療的應答，研究人員將EGFR突變(以下簡稱EGFR+)癌細胞MGH707與各種pdf共培養(yǎng)。在沒有pdf文件的情況下，EGFR TKI osimertinib (EGFRi)有效地阻斷了癌細胞的生長(圖a)。與某些pdf共培養(yǎng)基本上維持了EGFRi治療后癌細胞的增殖，而其他pdf僅提供適度或無保護(圖a)。通過相應的pdf條件培養(yǎng)基可以充分復制pdf影響的多樣性(圖2a)，這在7個pdf結合6個癌癥模型的隊列中得到了證實(圖b)。這些結果表明，pdf在決定egfr治療的整體療效方面發(fā)揮著重要作用。這種效果是異構的，并且是依賴于PDF的，支持PDF函數的多樣性。這些結果也表明pdf的拯救效應主要是由可溶性因子介導的，因此利用培養(yǎng)基對pdf進行高通量分析。研究人員進一步調查了38份來自EGFR+ NSCLC活檢的pdf，并評估了它們對三種使用EGFR治療的EGFR+腫瘤模型的挽救能力(圖c)。pdf與堿性NSCLC融合展示了一系列救援效果篩選+治療非小細胞肺癌細胞株篩選TKI lorlatinib(乙醇),即幾個pdf救出所有篩選+癌癥模型和其他pdf獲救的只有一些堿+癌癥細胞系(圖d-e)。這里的數據支持癌細胞有不同的能力和偏好利用鈣生成的分泌因子。重要的是，CAF功能的異質性neity是一個關鍵因素，它決定了特定的背景和癌癥-CAF交叉的強度，而這些交叉是對整體TKI反應的貢獻。
HGF和FGF7的表達定義了三種不同治療策略的CAFs亞型
由于MET和FGFR反復且有效地介導了cafedriven EGFRi耐藥，研究人員接下來根據它們激活這些通路的能力對pdf進行了分類。我們首先在另一種基因環(huán)境(ALK+)中測試了PDF的拯救能力，發(fā)現無論其原始腫瘤的致癌背景如何，對EGFRi具有顯著抗性的PDF也是ALKi的強大拯救者。因此，研究人員分析了所有60份pdf文件的EGFR TKI拯救譜，包括22份來自非EGFR+ nsclc的pdf文件，并確定了三種不同的CAFs功能亞型:亞型I通過MET穩(wěn)健且廣泛拯救EGFR，伴或不伴FGFR(包括CCD19-Lu);
亞型II主要通過FGFR獲得較溫和的拯救;
亞型III的挽救作用最小(圖a-b)。
通過對19份pdf(包括13份來自ALK+腫瘤)的隊列研究，我們一致發(fā)現，亞型I和II型pdf能夠通過ALKi挽救ALK+腫瘤，而亞型III型pdf則可以獲得更好的應答(圖c)。這三種功能定義的CAF亞型說明了克服CAF介導的治療耐藥的不同治療策略:需要met加FGFR通路阻斷來對抗I亞型CAFs的影響，II亞型CAFs需要FGFR通路阻斷，III亞型CAFs不需要聯合治療。至此，研究者將肺癌CAF定義為三種亞型：第I類以HGF-MET及FGF7-FGFR2為主要機制造成耐藥，并可給予MET抑制劑和FGFR抑制劑以強化腫瘤治療；第II類CAF以FGF7-FGFR2為主要機制造成耐藥，并可給予FGFR抑制劑以提升腫瘤療效；第III類CAF不造成或僅導致微弱腫瘤耐藥，進而不需要進一步干預。有趣的是，第III類CAF還能增強誘導免疫細胞遷徙，并與腫瘤病灶中CD8+ T細胞豐度相關，可能會對后續(xù)免疫治療策略的改進有幫助。
對肺癌CAF功能亞型與腫瘤耐藥、免疫相關的相關性研究
圖1
圖2
接下來研究人員通過RNAseq分析，對亞型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ做了差異分析，KEGG、GO富集（圖1a-b），與亞型Ⅲ PDFs相比，I亞型和II亞型PDFs中有3個通路與基因過表達相關，包括轉化生長因子b (TGF-b)信號通路，具有較高的統(tǒng)計學意義(圖1c)。研究人員發(fā)現它主要是上游但不是下游的基因,在接頭的TGF-b1 類型I和II pdf文檔,包括decorin(寬帶),fibromodulin(作用)和latent-TGF-b-binding蛋白1 (LTBP1)(圖1d)。值得注意的是，TGF-b1本身在所有三種亞型CAFs中表達相似(圖d)。因此推測，亞型I和II型pdf可能具有較低的TGF-b信號活性，因為它們過表達了這些抑制因子。信號分析證實，TGF-b信號轉導的兩個關鍵介質phospho-SMAD2和phospho-SMAD3在亞型III pdf中顯著存在，但在亞型I和亞型II pdf中僅有少量存在(圖1e)。與亞型IIpdf相比，亞型I和亞型IIIpdf在SMAD2和SMAD3總水平上似乎也具有更高的變異性(圖1e)。接下來，研究者研究了TGF-b信號是否控制HGF和FGF7的表達。成纖維細胞TGF-b信號的丟失與小鼠體內HGF分泌增加和旁分泌MET激活有關。在人肺CAFs中，TGF-b1治療抑制了I和II亞型pdf中HGF和FGF7的表達(圖1f-g)，并降低了它們產生EGFRi耐藥的能力?？偟膩碚f，這些數據表明，CAFs固有的TGF-b信號通路有助于成纖維細胞的功能異質性，部分是通過轉錄網絡，包括ETV1和TBX2。免疫檢查點阻斷已成為非小細胞肺癌的主要選擇。除了癌細胞的內在因素(例如，突變負擔)，成纖維細胞也可能影響腫瘤的免疫背景，接下來研究了CAF功能分類是否與患者腫瘤免疫狀態(tài)相關，所有TIL+活檢均有亞型pdf，而亞型Ⅰ和亞型Ⅱpdf僅在TIL活檢中存在，盡管可能由于樣本量小，差異沒有統(tǒng)計學意義(圖2a)。與亞型I和亞型ⅡPDFs相比，亞型III PDFs表達了多種對T淋巴細胞和單核細胞具有趨化特性的趨化因子，包括CXCL11、CXCL12、CCL14、CCL17和CCL20，且表達水平更高(圖2b)。為了從功能上分析和驗證CAFs的影響，研究人員設計了一種體外微流體分析方法來概括免疫細胞遷移過程。簡而言之，PDFs被嵌入I型膠原中，這是肺癌組織中表達的主要膠原類型，然后將免疫細胞懸浮培養(yǎng)在模擬腫瘤毛細血管的外周通道中(圖2c-d)?？傊@些數據表明，除了確定靶向治療的反應外，CAF功能分類也與不同水平的免疫細胞浸潤有關(圖2g)。隨著對其生物學和臨床影響的進一步了解，這里觀察到的現象也可以幫助設計癌癥免疫療法。
判斷CAF功能分類與臨床預后的相關性
接下來，我們通過分析三個患者隊列來檢驗CAFs的功能亞型是否與患者的臨床反應相關。在第一個隊列中，我們從12名隨后接受共價EGFR TKI治療的EGFR+ NSCLC患者中獲得了治療前活檢培養(yǎng)第一周條件培養(yǎng)液中的分泌組(因此分泌譜更類似于原始腫瘤)(圖a)。與先前研究結果一致，對EGFR TKI反應差的患者腫瘤分泌組中HGF和FGF7水平較高(圖a)。對于第二組13例患者(圖b)，我們從他們首次使用共價EGFR TKI治療前的活檢中建立了pdf文件。通過比較PDFs體外拯救表型和相應患者的臨床反應，我們發(fā)現，與PDFs分類為亞型或亞型的患者相比，含有亞型CAFs的腫瘤患者更有可能對EGFR TKI產生應答(圖b)。對于第三個獨立的EGFR+ NSCLC隊列，我們分析了從11名患者接受奧西美替尼治療前后的活檢中獲得的公共RNA-seq數據集。我們進一步證實，有限應答無進展生存期的NSCLC患者在奧西替尼前活檢中HGF和FGF7的表達更高(圖c)。對于反應較好的患者(PFS >12個月)，HGF和FGF7的表達通常在奧西替尼(耐藥)后活檢中增加。一致發(fā)現HGF和FGF7的間質豐度在疾病和治療過程中是動態(tài)的(圖d)。這些發(fā)現表明腫瘤微環(huán)境的進化是對治療壓力和/或疾病進展的反應。因此，研究人員進一步分析了來自6名患者縱向活檢的pdf，這些患者在兩次活檢之間至少接受了一條TKI治療線。從后期活檢中獲得的pdf通常比最初活檢中獲得的pdf更有說服力(圖e)，研究人員通過4個獨立的臨床隊列驗證了三個CAF功能亞型具有知道臨床預后的重要價值。
文章小結：
這個研究從成纖維細胞的角度對癌癥進行了亞型的分類，不僅在分子分型的角度對癌癥治療進行了研究，還和腫瘤耐藥，免疫治療，患者預后等多個臨床治療的問題相聯系，為肺癌精準治療提供了新的思路，創(chuàng)新性的手段也為之后的腫瘤精準治療提供了思路與借鑒，有望進一步提高腫瘤的緩解與治療療效。
