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NGS技術未來的一大方向，就是在對堿基進行測序的同時，記錄下檢測到的堿基來自的位置，通常是二維坐標系上的位置，有時還包括z軸這第三個維度。2021年12月15日，Nature主刊的論文，介紹了slide-DNA-seq技術，該技術可同時對DNA和mRNA進行原位測序的技術，并用其來研究癌組織的異質性。
細胞和組織的分化，受到其內(nèi)部DNA和RNA差異，以及由周圍細胞組成的環(huán)境因素這兩者的共同影響。對于腫瘤組織，其形成的原因，更是歸因于細胞內(nèi)的基因變異（例如單堿基突變，拷貝數(shù)變異，染色體級別的基因重組），以及腫瘤微環(huán)境。如能同時對腫瘤組織的表型，以及其不同位置的基因進行檢測，就能量化地研究基因和環(huán)境的因素是如何影響腫瘤組織的生成的，并了解腫瘤組織的異質性和轉移，復發(fā)和抗藥性之間的關系。
之前的研究腫瘤異質性，要么是對不同階段的腫瘤組織，進行高深度測序，根據(jù)突變頻率的差異，來估算不同階段腫瘤的演化；要么在晚期的腫瘤組織中，用激光切除一小塊，對其進行測序。相比來說，新推出的slide-seq，可以在一個直徑3毫米的視野內(nèi)，以10微米的分辨率，對每不同位置的聚苯乙烯珠子，添加對應空間位置的條形碼，標記空間位置，之后通過PCR擴增，實現(xiàn)DNA原位測序。在每個陣列中，包含2萬到4萬個柱子，每個珠子中，可以檢測到的DNA序列，約為165-421個。
slide-dna-seq的實驗流程
拿到slide dna-seq數(shù)據(jù)之后，標準的分析流程是怎樣了？該研究給出了可以兩種借鑒的套路，一是結合原位轉錄組數(shù)據(jù)，一是結合單細胞全基因組測序。在第一種套路下，對腫瘤組織的相鄰切片，分別進行原位RNA測序，染色和免疫熒光檢測和slide dna-seq。對得到的帶有位置信息的DNA覆蓋度數(shù)據(jù)，仿照空間轉錄組的模式，進行PCA降維，之后使用K-means聚類，將腫瘤組織分為幾個子類，如下圖所示的，該切片被分為了正常組織，以及兩種不同的腫瘤子克隆。
slide dna-seq分析方法：數(shù)據(jù)降維和聚類
為了說明對腫瘤組織分為兩個子類是有根據(jù)的，對不同類之間，不同位置上，染色體不同段之間的覆蓋度，使用雙邊置換檢驗計算P值，在不考慮多重比較的時候，將不同位置的p值以熱圖的形式展現(xiàn)，如下圖，可以看到分出的兩個子克隆，在特定的染色體上的覆蓋度，存在顯著的差異，且出現(xiàn)差異的位置，和不同分類的邊界一致。將全部染色體的覆蓋度繪制為散點圖，其中藍色代表正常組織，紅色和綠色代表兩種腫瘤組織的亞克隆，將顯著差異的部分區(qū)分開，可以看出其的確存在顯著的差異。由于檢測的是Kras誘導的肺腫瘤，因此其特有的6號染色體的擴增差異顯著，而在其它區(qū)域的覆蓋度則是正常的。
不同聚類的染色體覆蓋的散點圖和差異區(qū)域的p值在空間上的熱圖
在對相鄰的組織切片，使用slide-RNA-seq進行原位RNA檢測后，通過使用單細胞轉錄組的數(shù)據(jù)進行投影，同樣可以將進行組織聚類，得到的結果，和slide dna-seq的數(shù)據(jù)是相似的。將不同亞克隆中，各個基因的表達量差異（橫軸）和這種差異事虛假的可能性（縱軸），以火山圖的方式展示（圖f），可以找出不同亞克隆之間的差異基因，通過將這些基因的表達量以熱圖形式展示，可以看到在兩個亞克隆之間，找出的差異基因在空間上是有顯著差異的。
對相鄰腫瘤切片，進行原位轉錄組測序，得出的聚類圖，差異基因火山圖
接下來，要回答的問題，是確定每個腫瘤克隆中的RNA的特征。對相鄰的slide-dna-seq和slide-rna-seq，分別聚類后，繪制不同聚類的結果，以及腫瘤組織的癌細胞密度圖。之后將不同亞群（橫軸）及不同密度的癌細胞中，關鍵基因能解釋多少差異以熱圖展示，可以發(fā)現(xiàn)兩個亞克隆，存在著不同的進化路徑。而不同位置的腫瘤組織中癌細胞密度的差異，也可以歸因于LGALS3，這個在腫瘤抑制中發(fā)揮作用的基因，以及PROMI基因，其和腸道內(nèi)平衡，再生和腫瘤生成有關。
另一種套路，是將原位轉錄組測序換成單細胞dna測序。由于在10微米的分辨率上，是存在多個細胞的，因此該套路的最初步驟，和前面描述的類似。對短序列進行比對后得到1兆區(qū)域內(nèi)的覆蓋度信息（平滑處理，去除實驗帶來的波動），PCA聚類后找出差異的區(qū)域。但區(qū)別在于，對單細胞DNA測序的數(shù)據(jù)，同樣比對后計算不同區(qū)域的覆蓋度，之后距離，再將使用單細胞DNA測序得到的聚類投影到slide dna-seq上，
使用slide dna-seq和單細胞WGS對腫瘤異質性進行多組學分析的套路
從圖e和f可以看出，使用單細胞wgs和slide dna-seq，對相鄰組織切片可以得出相近的結果，即都是chr8上，不同腫瘤組織間存在顯著差異，這也可以從圖g的平均覆蓋度散點圖中看出，藍色代表的亞型，其在chr8上的覆蓋深度更高，意味著其中的拷貝數(shù)更多。而從圖c的染色切片和聚類結果的對比，可以看出兩者有類似的空間模式。
總結dna-slide-seq技術，通過提供高分辨率，高敏感度的原位dna測序，該方法適合對具有異質性的腫瘤組織，結合原位轉錄組，進行多組學分析，可采用于最直接的基因組覆蓋度的差異，以描述不同位置腫瘤的染色體拷貝數(shù)差異，是如何于差異位置的基因表達量差異相一致的。而結合單細胞全基因數(shù)據(jù)，則可以將相鄰部分的數(shù)據(jù)整合，考察不同位置腫瘤組織中，癌細胞雜合缺失程度的變化。
未來，使用dna-slide-seq可以構建描述腫瘤組織隨時間演化過程的數(shù)據(jù)庫，或將該技術應用于臨床診斷，通過判別腫瘤亞型，找出和生產(chǎn)率，轉移及復發(fā)有關的亞型，并定位關鍵基因。該技術不僅僅適用于腫瘤組織，其實驗的關鍵，即在擴增前，在組織原位加上標記序列，可用于空間宏基因組，或檢測空間不同位置的甲基化或染色質開放性水平。
Tongtong Zhao, Zachary D. Chiang et al.Spatialgenomics enables multi-modal study of clonal heterogeneity in tissues
