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                                                                    下呼吸道菌群失調(diào)影響肺癌進(jìn)展

嗨咯~大家好呀，今天小編給大家?guī)硪黄衲臧l(fā)表在Cancer Discov.（中科院JCR分區(qū)1區(qū)，IF: 39.397）的高分文章，本研究干濕結(jié)合，相得益彰，一起來欣賞學(xué)習(xí)大佬的研究成果吧！

研究背景及意義

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其發(fā)病率和死亡率高居不下。靶向治療可以提高患者的生存率，然而其僅適用于約30%的肺腺癌患者。免疫治療新療法已被證明可影響患者體內(nèi)T細(xì)胞對腫瘤抗原的反應(yīng)，并提高肺癌患者的生存率，然而仍有40%~60%的患者對其無效或產(chǎn)生耐藥性。已有研究在小鼠實(shí)驗(yàn)和對免疫治療反應(yīng)的癌癥患者的分析中確定了與增強(qiáng)抗腫瘤免疫和對免疫治療反應(yīng)相關(guān)的腸道微生物。而這些研究大多集中在腸道微生物，呼吸道微生物和肺癌的相關(guān)性研究鮮少被提及。同時(shí)，研究表明正常個(gè)體的下呼吸道通常含有普雷沃氏菌和韋氏菌等口腔細(xì)菌，作者在先前的研究已證明了以口腔共生菌富集為特征的呼吸道菌群失調(diào)與個(gè)體的肺部炎性加重有關(guān)，這樣的菌群失調(diào)可能觸發(fā)宿主轉(zhuǎn)錄組信號改變（PI3K和 MAPK）。

為了進(jìn)一步探究呼吸道微生物在肺癌中的臨床意義，作者利用前瞻性人群隊(duì)列和小鼠模型來確定可能影響肺癌預(yù)后的呼吸道微生物菌群。

結(jié)果解讀

樣本收集

作者團(tuán)隊(duì)在2013年3月至2018年10月間，從NYU Lung Cancer Biomarker Center招募了148名患有肺結(jié)節(jié)的受試者，這些患者都接受了臨床支氣管鏡檢查，作者從檢查中獲得了下呼吸道刷用來進(jìn)行下一步研究，所有樣本均在患者接受治療前獲得。其中15例患者為非肺原發(fā)腫瘤(轉(zhuǎn)移)，12例患者為良性肺結(jié)節(jié)，38例患者為其他良性診斷而被排除未納入研究隊(duì)列，其余83名患者最終診斷為原發(fā)性肺癌，并被納入這項(xiàng)研究。 在這些患者中，均有16S測序數(shù)據(jù)，70例患者有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，40例患者有RECIST（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors）評估，75例患者有超過6個(gè)月的臨床隨訪數(shù)據(jù)，64例患者有超過12個(gè)月的臨床隨訪數(shù)據(jù)。樣本臨床信息見下表。

表1：研究隊(duì)列臨床信息表

肺癌進(jìn)展相關(guān)微生物特征的挖掘

（1）不同部位樣本的菌群差異

除了下呼吸道刷外，作者還從患者的支氣管鏡檢查中獲得了上呼吸道刷（口腔部）和支氣管鏡檢查背景對照樣本，這些樣本被納入16S 測序分析從而一并比較?；贐ray-Curtis 相異度指數(shù)的PCoA分析表明，不同部位樣本的菌群β多樣性顯著不同（Figure 1a, PERMANOVA, p<0.001）。而在下呼吸道樣本中，小細(xì)胞肺癌（SC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的菌群β多樣性也顯著不同（PERMANOVA, p=0.01）。

（2）基于NSCLC臨床TNM分期分類樣本的菌群差異

在NSCLC樣本中，作者根據(jù)臨床TNM分期，同時(shí)基于以往的預(yù)后/生存數(shù)據(jù)和與NSCLC手術(shù)治療相關(guān)的癌癥管理指南，將樣本分為I-IIIA和IIIB-IV這兩組。PCoA分析表明，這兩組樣本的菌群β多樣性存在顯著差異（Figure 1b, PERMANOVA, p=0.005）。相比于I-IIIA組，IIIB-IV組的呼吸道樣本菌群構(gòu)成更接近口腔樣本的菌群構(gòu)成（Figure 1b, Bray Curtis Distance, p<0.0001）。同時(shí)作者也比較了各個(gè)分期（I-IV）樣本的菌群特征，結(jié)果表明，越晚期的病人樣本，其呼吸道樣本的菌群構(gòu)成越接近于口腔樣本的菌群構(gòu)成。而MiRKAT分析表明，NSCLC I-IIIA組和IIIB-IV組之間的微生物群落分布差異并非由于樣本位置的不同引起。

（3）不同PD-L1表達(dá)的病人樣本的菌群差異

作者在腫瘤PD-L1表達(dá)值可獲得的部分病人（n=39）中研究發(fā)現(xiàn)，相比于低表達(dá)PD-L1的病人（0%, n=16 和 1–79%, n= 11），高表達(dá)PD-L1的病人（(≥80%, n=12）其呼吸道樣本的菌群構(gòu)成更接近口腔樣本的菌群構(gòu)成(Supplementary Figure 5, Bray Curtis Distance, p<0.05)。

（4）不同生存率病人樣本的菌群差異

PCoA分析確定了基于6個(gè)月和12個(gè)月生存率的病人樣本，菌群成分具有顯著差異(Figure 1c, PERMANOVA, p<0.05)，其中，與預(yù)后較好的病人相比，存活率較低的病人樣本的菌群構(gòu)成更接近口腔樣本的菌群構(gòu)成（Figure 1c, Bray Curtis Distance, p<0.0001）。而多元PERMANOVA分析表明，不同生存率病人其呼吸道菌群的差異與TNM分期無關(guān)。

（1）（2）（3）（4）結(jié)果初步表明，不同分組肺癌病人的呼吸道菌群存在顯著差異，惡性程度越高的病人，其呼吸道菌群擁有越多的口腔共生菌。

（5）肺癌進(jìn)展相關(guān)OTUs挖掘

作者在前面研究中，已初步探究到肺癌不同進(jìn)展病人的呼吸道菌群構(gòu)成存在差異，作者在接下來的研究中運(yùn)用DESeq分析進(jìn)一步尋找具體的差異OTUs（I-IIIA vs. IIIB-IV groups of NSCLC）。

基于矯正樣本來源部位因素影響的混合效應(yīng)模型，作者探究在NSCLC 中I-IIIA組和IIIB-IV組間豐度差異的top20 OTUs（根據(jù)絕對系數(shù)排序），結(jié)果表明，IIIB-IV組病人下呼吸道顯著富集了在先前研究中被認(rèn)為是口腔共生菌的OTUs，如嗜血桿菌屬，梭桿菌屬，孿生球菌屬，普雷沃氏菌屬和顆粒鏈菌屬等（Supplementary Table 3）。而在I-IIIA組和IIIB-IV組內(nèi)研究中，生存率較差的樣本相比于生存率較好的樣本，韋榮氏球菌屬，普雷沃氏菌屬和顆粒鏈菌屬等顯著增加（Supplementary Figure 9a–d, Supplementary File Table 2–5）。進(jìn)一步的研究中，作者基于矯正樣本來源病人的吸煙狀態(tài)，TNM分期，以及治療類型等因素影響的混合效應(yīng)模型，確定了與肺癌總生存率相關(guān)的top20 OTUs，結(jié)果表明肺癌的不良預(yù)后與普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬和孿生球菌屬等口腔共生菌在下呼吸道的富集高度相關(guān)（Supplementary Table 4）。

而基于狄利克雷多項(xiàng)式模型（Dirichlet Multinomial Model, DMM），作者確定了樣本可分為兩類：第一類由所有上呼吸道樣本和60%的下呼吸道樣本組成，第二類由所有支氣管鏡背景對照樣本和40%的下呼吸道樣本組成。 與上呼吸道樣本聚為一起的下呼吸道樣本（60%）主要富集了韋榮氏球菌屬、鏈球菌屬、普雷沃氏菌屬和嗜血桿菌屬等，作者將這些菌群定義為SPT（supraglottic predominant taxa）。而與支氣管鏡背景對照樣本聚為一起的下呼吸道樣本（40%）則主要富集了黃桿菌屬和假單胞菌屬等，作者將這類菌群定義為BPT（background predominant taxa）（Supplementary Figure 12）。 與I-IIIA期NSCLC患者相比，IIIB-IV期NSCLC患者下呼吸道樣本中被歸類為富集SPT的樣本占比更高(Figure 1d, p=0.006)。 而Kaplan-Meier生存分析顯示，在I-IIIA期NSCLC患者中，SPT型比BPT型生存期更差(Figure 1e, p=0.047)，在IIIB-IV期NSCLC患者中，SPT型和BPT型的生存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異。進(jìn)一步的，作者在IIIB-IV期NSCLC患者中評估菌群與臨床RECIST打分的相關(guān)性，在這部分病人中，上呼吸道和下呼吸道樣本間的Bray-Curtis 相異度指數(shù)和RECIST打分呈顯著負(fù)相關(guān)（Spearman r = ?0.48, p=0.03）。因此，盡管這部分病人的總生存率與SPT型和BPT型分類無關(guān)，但該結(jié)果依然證明了RECIST評分為陽性（腫瘤進(jìn)展）與下呼吸道的菌群構(gòu)成更接近于上呼吸道的菌群構(gòu)成有關(guān)，RECIST評分為陽性的病人下呼吸道中富集了更多的SPT（Supplementary Figure 14）。

作者在這部分結(jié)果中，進(jìn)一步確認(rèn)了與肺癌進(jìn)展相關(guān)的OTUs，并將其定義為SPT（supraglottic predominant taxa）和BPT（background predominant taxa）。

Figure 1. Lung microbiota in lung cancer and cancer survival.

與SPT和BPT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組特征

作者從70例NSCLC患者的下呼吸道樣本中獲得了RNA-seq數(shù)據(jù)。不同于微生物特征，I-IIIA組和IIIB-IV組間的Bray-Curtis 相異度指數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒有差異，DESeq分析僅在兩組間找到20個(gè)差異表達(dá)基因，同樣的，在不同生存率病人間，也僅有很少的差異表達(dá)基因被找到（Supplementary File Table 8）。

不同于尋常的分期分組，在基于SPT和BPT分型的樣本分組中，更多的差異表達(dá)基因被挖掘（Figure 2a, FDR<0.25）。對這些差異基因進(jìn)行功能富集發(fā)現(xiàn)，SPT與p53突變、PI3K/PTEN、ERK和IL-6/IL-8等典型通路的上調(diào)有關(guān)。

作者在這部分結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)SPT和BPT可引起宿主轉(zhuǎn)錄組信號改變

多組學(xué)分析

為了更好的探究肺癌中宿主/微生物相互作用，作者運(yùn)用了一個(gè)多組學(xué)分析框架（共現(xiàn)概率網(wǎng)絡(luò)），以此來評估菌群與宿主的轉(zhuǎn)錄組特征共現(xiàn)的概率，同時(shí)用MMvec計(jì)算菌群出現(xiàn)在I-IIIA進(jìn)展期和 IIIB-IV進(jìn)展期的概率大小，并將其添加進(jìn)網(wǎng)絡(luò)中（Figure 2c），最后作者運(yùn)用decontam軟件包去除噪聲，最終確認(rèn)了韋榮氏球菌屬（OTU#585419）為與肺癌進(jìn)展最相關(guān)的OTUs，其還與細(xì)胞粘附分子、IL-17、細(xì)胞因子和生長因子、趨化因子信號通路、TNF、Jak-STAT、PI3K-Akt信號通路高度相關(guān)（Supplementary File Table 10）。基于BLAST，該OTUs最終被比對注釋為Veillonella parvula。

作者在這部分結(jié)果中，最終確認(rèn)了Veillonella parvula為呼吸道菌群中與肺癌進(jìn)展最相關(guān)的菌

Figure 2. Airway transcriptome in NSCLC lung cancer based on lung microbiota.

呼吸道生態(tài)失調(diào)小鼠模型

作者在肺癌小鼠模型中驗(yàn)證由Veillonella parvula引起的下呼吸道生態(tài)失調(diào)對肺癌進(jìn)展的影響（KP模型小鼠，F(xiàn)igure 3a）。結(jié)果表明，Veillonella parvula引起的下呼吸道生態(tài)失調(diào)對野生型小鼠的生存和體重不影響，而Veillonella parvula引起的下呼吸道生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致KP模型肺癌小鼠生存期減少，體重降低，腫瘤負(fù)荷增加（Figure 3a, 3b, Supplementary Figure 18a,b）。

同時(shí)作者在生態(tài)失調(diào)誘導(dǎo)后第3周做了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、基于FACS的T細(xì)胞譜數(shù)據(jù)和細(xì)胞因子測量數(shù)據(jù)來評估模型對生態(tài)失調(diào)的免疫反應(yīng)：Ⅰ、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的PCoA分析結(jié)果顯示，四種實(shí)驗(yàn)條件之間（WT, Dys, LC, LC+Dys）存在明顯差異，其中LC+Dys組的轉(zhuǎn)錄組特征變化比LC組更大（Supplementary Figure 19a）。Ⅱ、基于CIBERSORT的腫瘤免疫微環(huán)境分析，明確了下呼吸道生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致Th1細(xì)胞增加和樹突狀細(xì)胞激活（Supplementary Figure 19b）。Ⅲ、IPA分析結(jié)果顯示，下呼吸道生態(tài)失調(diào)也導(dǎo)致了PI3k/Akt，ERK/MAPK，IL-17A，IL-6/IL-8和炎癥小體信號通路的上調(diào)（Figure 3c）。

作者在比較小鼠模型中下呼吸氣道生態(tài)失調(diào)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組信號與SPT型NSCLC病人中識別的轉(zhuǎn)錄組信號時(shí)，發(fā)現(xiàn)IL-17信號、趨化因子、TOLL樣受體、PD-L1信號和PI3K-Akt信號等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組特征信號變化是一致的。最終，作者得出結(jié)論，Veillonella parvula引起的下呼吸道生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致Th17細(xì)胞增多，IL-17水平升高，PD-1⁺ T細(xì)胞表達(dá)增加，中性粒細(xì)胞增多（Figure 3e, Supplementary Figure 22a）。而CD4+、CD8+和中性粒細(xì)胞的免疫組化結(jié)果表明，這些炎性細(xì)胞的增加主要發(fā)生在沒有腫瘤侵襲的肺組織中（Figure 3e）。

Figure 3. Pre-clinical model of lung dysbiosis in lung cancer and cancer survival.

為了進(jìn)一步評估失調(diào)誘導(dǎo)的IL-17激活在肺癌進(jìn)展中的重要性，在KP小鼠模型腫瘤發(fā)生后用抗IL-17單克隆抗體和同型對照抗體治療小鼠兩周（Figure 4a）。結(jié)果表明，和對照組相比，抗IL-17單抗治療后的小鼠腫瘤負(fù)荷明顯降低（p=0.0059, Figure 4b）。免疫微環(huán)境分析表明，抗IL-17單抗治療后的小鼠，RORγt⁺ CD4⁺ T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)明顯降低，免疫組化結(jié)果表明，這些炎性細(xì)胞的減少發(fā)生在在沒有腫瘤侵襲的肺組織中，而并非發(fā)生在肺癌組織中（Figure 4c, 4d）。

Figure 4. IL-17 blockade during lung dysbiosis in lung cancer preclinical model.

作者在這部分結(jié)果中，驗(yàn)證了Veillonella parvula引起的下呼吸道生態(tài)失調(diào)可促進(jìn)肺癌腫瘤炎癥微環(huán)境，表現(xiàn)為Th17 細(xì)胞增多，激活具有潛在抗原呈遞能力的樹突細(xì)胞，以及癌旁組織中檢查點(diǎn)抑制劑標(biāo)記物的增加。

小編總結(jié)

在這項(xiàng)研究中，作者首次提出并證實(shí)了肺癌患者下呼吸道菌群的失調(diào)將會改變宿主的轉(zhuǎn)錄組信號通路以及促進(jìn)腫瘤炎癥微環(huán)境，從而影響肺癌發(fā)生發(fā)展和病人預(yù)后。在通篇研讀完這篇文章后，小編不禁感慨這篇高分文章工作量之大，細(xì)節(jié)處理之妙，上下文結(jié)構(gòu)遙相呼應(yīng)，干濕結(jié)合，邏輯通暢，建議大家下載原文來研讀學(xué)習(xí)！