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最近小編發(fā)現(xiàn)，除了腫瘤分型，基因集、明星通路、熱點(diǎn)表型建模外，既往被高強(qiáng)度研究過的癌基因還有巨大的挖掘價(jià)值。今天就給大家?guī)硪黄訰as相關(guān)蛋白為主角的生信meta研究，并非常規(guī)的生信套路文章，研究思路設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，這就給各位解讀一下！
文章“Identification of RASSF1A promoter hypermethylation as a biomarker for hepatocellular carcinoma”發(fā)表在《Cancer Cell Int》，影響因子6.26分。
背景介紹:
RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（RAS association domain family 1A, RASSF1A）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)候選腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene, TSG），該基因的失活在多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。雖然基因缺失和點(diǎn)突變可引起基因的失活，但大量研究表明，該基因的失活與其啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)。這種表觀遺傳學(xué)機(jī)制可使多種抑癌基因失活，并被證實(shí)為腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因。
結(jié)果展示：
Screening of studies
文獻(xiàn)篩查
首先制定文獻(xiàn)檢索策略：search strategy of (HCC OR hepatocellular carcinoma OR liver cancer) AND (hypermethylation OR methylation OR epigenetics) AND (RASSF1A or RASSF1 or Ras association domain family 1 A)
經(jīng)過文獻(xiàn)檢索，作者初步納入479篇研究(圖1)，首先排除重復(fù)文獻(xiàn)208個(gè)，排除與研究內(nèi)容無關(guān)文獻(xiàn)的218個(gè)。此外，有15個(gè)研究觀測指標(biāo)與作者研究內(nèi)容不相關(guān)被排除。最后，共計(jì)44個(gè)研究負(fù)荷作者的研究主題：12項(xiàng)研究提供了肝癌的RASSF1A啟動(dòng)子甲基化頻率數(shù)據(jù)，并評估了這種甲基化與臨床病理特征的相關(guān)性。29項(xiàng)研究僅提供了肝癌患者的RASSF1A啟動(dòng)子甲基化頻率，3項(xiàng)研究僅提供了肝癌患者的臨床病理特征。
Characteristics of the enrolled articles
納入文獻(xiàn)的基線資料
入選研究的特征如表1所示。研究年限從2002年到2019，共計(jì)44項(xiàng)病例對照研究，包含4777名肝癌患者。納入研究的地域較廣，有28篇文章來自亞洲。8篇文獻(xiàn)來自美國，其次是非洲(n = 5篇)，意大利和德國各發(fā)表一篇。檢測樣本主要有三種來源，包括組織(n = 31)、外周血(n = 11)以及組織和外周血同時(shí)調(diào)查(n = 2)。在入組的研究中，肝癌患者為病例組，正常樣本為對照組，并被分配到非腫瘤組和正常組。在評估肝癌診斷效率的研究中，采用血液（n=11），采用組織（n=31），同時(shí)檢查了血液和組織（n=2）。采用異質(zhì)性檢驗(yàn)評估入組研究中RASSF1A的甲基化狀態(tài)。采用Newcastle-Ottawa scale (NOS) 評估41個(gè)報(bào)道病例和對照組RASSF1A甲基化頻率的研究質(zhì)量。評分范圍5 - 8分，表明具有相對較高的質(zhì)量。另外3項(xiàng)研究僅報(bào)道肝癌的床病理特征，未進(jìn)行評估。
Effect of RASSF1A promoter hypermethylation on HCC in the pooled analyses
Comparison of RASSF1A promoter hypermethylation between HCC and non-tumor groups
匯聚分析RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化對肝癌的影響
比較肝癌組與非腫瘤組RASSF1A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)
作者匯聚了34研究，涉及2075名肝癌樣本和2276名非肝癌樣本。通過meta分析評價(jià)RASSF1A基因啟動(dòng)子上甲基化與肝癌發(fā)生率的關(guān)系(圖2)。作者發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化頻率與較高的患肝癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān), (odds ratio [OR] = 6.87, 95% confidence interval [CI] = 4.98–9.50, P < 0.001)，結(jié)果異質(zhì)性中等(I 2 = 64.1%, P = 0.000)。
作者進(jìn)一步按樣本類型(血液和組織)、檢測方法和樣本大小對納入研究進(jìn)行亞組分析，探索可能的異質(zhì)性來源。亞組分析顯示，RASSF1A基因啟動(dòng)子高甲基化與患肝癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(blood: OR = 6.93, 95% CI = 4.12–11.65, P < 0.001; tissue:OR = 7.12, 95% CI = 4.78–10.59, P<0.001)。此外，在檢測方法的亞組分析中，RASSF1A基因啟動(dòng)子高甲基化與肝癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(MSP: OR = 7.30, 95% CI = 5.17–10.29, P < 0.001; others: OR = 6.20, 95% CI = 3.13–12.30, P < 0.001)。樣本大小亞組分析結(jié)果與匯聚分析的結(jié)果是一致的(≥ 100:OR = 6.74, 95% CI = 4.28–10.61, P<0.001; < 100:OR = 6.67, 95% CI = 4.46–10.00, P < 0.001) (圖3)。
Comparison of RASSF1A promoter hypermethylation between HCC and normal groups
HCC組與正常組RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化水平比較
作者接下來首先利用來自26項(xiàng)研究的1898名肝癌樣本和1002名正常樣本的檢測數(shù)據(jù)評估RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化如何患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)(圖4)。
meta分析提示與對照組相比，RASSF1A基因的啟動(dòng)子甲基化與肝癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(OR = 31.05, 95% CI = 13.73–70.20, P < 0.001)；但是，納入文獻(xiàn)存在較高的異質(zhì)性(I 2 = 79.6%， P = 0.000)。進(jìn)行亞組分析后的meta結(jié)果顯示，RASSF1A啟動(dòng)子甲基化與HCC風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(圖3)。
Relationship of the promoter hypermethylation of RASSF1A with the clinicopathological features
RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與臨床病理特征的關(guān)系
作者通過提取納入研究的肝癌患者基線數(shù)據(jù)分析RASSF1A基因啟動(dòng)子高甲基化與臨床病理特征相關(guān)性。臨床病理特征與RASSF1A基因的相關(guān)性展示在表2。Meta分析顯示RASSF1A啟動(dòng)子的高甲基化與腫瘤大小，乙型肝炎病毒(HBV)感染顯著相關(guān)。與性別，年齡，丙型肝炎病毒(HCV)，甲胎蛋白(AFP)水平，腫瘤數(shù)量,肝硬化,組織病理學(xué),腫瘤分化或門靜脈侵犯無顯著相關(guān)性,
Meta regression and sensitivity analyses
Meta回歸和敏感性分析
作者對兩組中RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與肝癌風(fēng)險(xiǎn)的薈萃回歸分析結(jié)果顯示，樣本類型、檢測方法和樣本量存在趨勢。但是，meta結(jié)果中也檢測到異質(zhì)性。對此，作者利用亞組分析評估了不同特征對異質(zhì)性的影響程度，然而大多數(shù)亞組的P值＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組的異質(zhì)性區(qū)間為9.70% ~ 8.14%，殘差異質(zhì)性水平較高。由于入組的研究缺乏足夠的數(shù)據(jù)，作者沒有將其他可能導(dǎo)致異質(zhì)性的因素納入meta回歸分析。
接下來，作者通過敏感性分析進(jìn)一步研究兩組合并結(jié)果的穩(wěn)健性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型逐個(gè)剔除納入的研究。沒有一項(xiàng)研究對匯集的結(jié)果有顯著的影響，表明作者的估計(jì)是穩(wěn)健和可靠的。
Publication bias
發(fā)表性偏移
對于非腫瘤組，漏斗圖似乎不對稱，Begg’s檢驗(yàn)(P = 0.021),提高發(fā)表性偏移。但是Eegg’s (P = 0.208)沒有檢測出發(fā)表性偏移。隨后，采用修剪和填充法評估發(fā)表偏倚對meta結(jié)果的影響。最后，作者通過增加10個(gè)負(fù)向結(jié)果的研究再次生成了對稱漏斗圖。作者通過meta分析得到的這些結(jié)果仍然顯著。同樣，對于正常組，Egger s檢驗(yàn)和漏斗圖顯示存在潛在的發(fā)表偏倚。隨后，7個(gè)負(fù)性研究通過修飾和填充方法進(jìn)行填充，合并分析發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子甲基化與肝癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。
Association of the promoter hypermethylation of RASSF1A with HCC related prognoses
RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與HCC相關(guān)預(yù)后的關(guān)系
Baseline patient characteristics
患者基線特征
作者接下來，評估了TCGA的肝癌樣本及非腫瘤樣本的RASSF1A-DNA甲基化數(shù)據(jù)，選取原位定位于RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)域的11個(gè)探針(cg13872831、cg24859722、cg04743654、cg00777121、cg08047457、cg12966367、cg21554552、cg25747192、cg06172942、cg25486143、cg27569446)，均含有RASSF1A基因CpG島A (chr3: 50340373–50341109)。
在TCGA隊(duì)列中，肝癌樣本中的RASSF1A啟動(dòng)子甲基化水平顯著高于鄰近的非癌性肝組織。根據(jù)探針甲基化水平，所有樣品分為低甲基化組(n = 196)和高甲基化組(n = 184)。在380例TCGA來源的肝癌樣本中，349例有總生存期(OS)和生存狀態(tài)的信息，而342例有無病生存期(DFS)和復(fù)發(fā)狀態(tài)的數(shù)據(jù)。
RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化在預(yù)測HCC相關(guān)預(yù)后中的作用
作者進(jìn)行Kaplan Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，RASSF1A基因啟動(dòng)子高甲基化的患者的總生存期OS較差, 但是DFS高于低甲基化組。另外，受試者工作特征(ROC)曲線分析，RASSF1A基因啟動(dòng)子高甲基化預(yù)測肝癌患者1、2、3和5年OS的曲線下面積分別為0.51、0.60、0.60和0.58。同時(shí)，RASSF1A基因啟動(dòng)子高甲基化預(yù)測肝癌患者1、2、3和5年DFS的時(shí)間依賴性AUC值分別為0.61、0.69、0.63和0.73。據(jù)此，作者推斷RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)具有較高的敏感性和特異性(圖5)。
結(jié)論：
Meta分析納入了涉及4777人的44項(xiàng)研究。肝癌患者RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率明顯高于非腫瘤患者和健康個(gè)體，且與乙肝病毒(HBV)感染陽性和腫瘤大小顯著相關(guān)。Kaplan Meier生存分析顯示，RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化的HCC患者預(yù)后較差。受試者工作特性曲線證實(shí)，RASSF1A啟動(dòng)子甲基化可能是肝癌相關(guān)預(yù)后的標(biāo)志。
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