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肺癌異質(zhì)性分析還能發(fā)18+
利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析肺癌中細(xì)胞組成的文章日益增多，但只要找好研究角度仍然可以發(fā)高分文章。今天分享一篇一月份發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=18.187）的文章，通過(guò)整合單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)和其他組學(xué)數(shù)據(jù)，揭示肺癌生存相關(guān)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄模塊。
一 研究背景
肺癌在世界范圍內(nèi)仍然是惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，其病因和生物學(xué)上的異質(zhì)性是導(dǎo)致治療失敗和預(yù)后不良的重要原因。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell Lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell Lung cancer, SCLC)。NSCLC占肺癌病例的85%，主要由肺腺癌(LUAD)和肺鱗癌(LUSC)兩種亞型組成，這兩種亞型是根據(jù)腫瘤的臨床和組織學(xué)特征確定的。遺傳、表觀遺傳和微環(huán)境特征可以影響細(xì)胞程序并導(dǎo)致不同的NSCLC發(fā)病機(jī)制。由于潛在的異質(zhì)性，統(tǒng)一的治療策略可能會(huì)失敗，導(dǎo)致預(yù)后不良。LUAD和LUSC之間的異質(zhì)性和細(xì)胞組成的差異，以及這些細(xì)胞組成在多大程度上影響患者的生存仍在很大程度上有待探索。因此，更好地理解肺癌異質(zhì)性的各種來(lái)源，包括遺傳、表觀遺傳、細(xì)胞和微環(huán)境特征，是一個(gè)具有廣泛治療意義的關(guān)鍵目標(biāo)。
本文作者使用了一種綜合的方法來(lái)了解NSCLC的異質(zhì)性，結(jié)合了LUAD和LUSC患者在多個(gè)腫瘤階段的scRNA-seq，bulk RNA-seq、全基因組測(cè)序（WGS）和ATAC-seq數(shù)據(jù)集。通過(guò)scRNA-seq確定了已知存在于肺癌中的各種細(xì)胞類型，包括II型肺泡細(xì)胞（AT2）、基底細(xì)胞和各種骨髓和淋巴細(xì)胞。揭示了主要肺癌亞型中不同的細(xì)胞組成，并確定了與預(yù)后不良有關(guān)的亞組。研究發(fā)現(xiàn)，LUAD和LUSC在AT2和基底細(xì)胞亞群中有選擇性的擴(kuò)增，并且具有與肺癌低生存率相關(guān)的獨(dú)特的細(xì)胞組成模塊。惡性和階段特異性基因分析進(jìn)一步揭示了腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和基因。此外，在AT2和基底細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了具有增殖和分化特性的亞簇。亞簇標(biāo)記AQP5和KPNA2等10個(gè)基因的過(guò)表達(dá)分析進(jìn)一步揭示了它們的功能，為肺癌的早期診斷和治療提供了潛在的靶點(diǎn)。
二 主要結(jié)果
構(gòu)建LUAD和LUSC的多組學(xué)圖譜
為了全面了解NSCLC的細(xì)胞類型組成和轉(zhuǎn)錄譜，作者生成了LUAD和LUSC的單細(xì)胞和多組學(xué)圖譜。在華西醫(yī)院（WCH）的32名未經(jīng)治療的患者中，共獲得52個(gè)新鮮的手術(shù)切除的肺部腫瘤和鄰近組織，包括11個(gè)配對(duì)的原發(fā)和鄰近LUAD樣本，8個(gè)未配對(duì)的LUAD和2個(gè)鄰近樣本，以及9個(gè)配對(duì)的原發(fā)和鄰近LUSC患者和2個(gè)額外的原發(fā)LUSC樣本，共21名肺腺癌和11名鱗癌患者(圖1a, b)。共有220716個(gè)細(xì)胞通過(guò)質(zhì)量控制，其中127593個(gè)細(xì)胞來(lái)自腫瘤組織，93123個(gè)細(xì)胞來(lái)自相應(yīng)的鄰近肺組織?？偣矙z測(cè)到17277個(gè)基因，平均每個(gè)細(xì)胞1424個(gè)基因，突顯出該數(shù)據(jù)集的高質(zhì)量。作者還整合了之前的數(shù)據(jù)集，包括全基因組測(cè)序(WGS)、ATAC-Seq和bulk RNA測(cè)序，這些數(shù)據(jù)來(lái)自45名肺癌患者(圖1b)和4名良性肺腫瘤患者的獨(dú)立隊(duì)列?？傊?，作者構(gòu)建了LUAD和LUSC在體分辨率和單細(xì)胞分辨率上的多組學(xué)圖譜。
為了定義每個(gè)細(xì)胞類型，作者使用Seurat 和Harmony 來(lái)處理293,432個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行質(zhì)量控制、歸一化、批量效應(yīng)校正和聚類。所有的細(xì)胞都通過(guò)UMAP進(jìn)行可視化，并根據(jù)已知群體的標(biāo)志性基因的表達(dá)水平聚類到特定的細(xì)胞類型，每個(gè)樣本都顯示出細(xì)胞組成的差異。作者在LUAD和LUSC的腫瘤和鄰近組織中確定了17個(gè)主要的細(xì)胞群（圖1c，d），每個(gè)細(xì)胞類型平均有5050個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本（圖1e）。分類后的細(xì)胞群可分為兩組，非免疫細(xì)胞，包括基底細(xì)胞（Basal）、肺泡II型細(xì)胞（AT2）、肺泡I型細(xì)胞（AT1）、纖毛細(xì)胞（Cilia）、俱樂(lè)部細(xì)胞（Club）、內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、成纖維細(xì)胞（Fib）和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（NE）。其余的細(xì)胞是構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境的九個(gè)免疫細(xì)胞群，包括B細(xì)胞（B）、CD4+T細(xì)胞（CD4）、CD8+T細(xì)胞（CD8）、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、粒細(xì)胞（Gran）、肥大細(xì)胞（Mast）、巨噬細(xì)胞（Mφ）、自然殺傷細(xì)胞（NK）和調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Tregs）（圖1f）。最后，根據(jù)第八版肺癌TNM分類法對(duì)其原發(fā)病人的分類，將每個(gè)細(xì)胞群分配到腫瘤階段。來(lái)自早期階段（I期和II期）的細(xì)胞占LUAD的63.2%，而LUSC約87%的細(xì)胞來(lái)自早期階段的樣本（圖1g）?？傊瑂cRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)了LUAD和LUSC的多種免疫和非免疫細(xì)胞類型，揭示了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和不同亞型肺癌的腫瘤微環(huán)境。
繪制非小細(xì)胞肺癌惡性細(xì)胞異質(zhì)性
為了審視NSCLC惡性細(xì)胞的瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性，首先將細(xì)胞分為惡性和非惡性細(xì)胞類型（圖2a）。對(duì)于每種細(xì)胞類型，使用inferCNV根據(jù)每個(gè)染色體區(qū)域100個(gè)基因的平均表達(dá)推斷出拷貝數(shù)變異（CNV）。例如，我們?cè)贚UAD患者的AT2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大規(guī)模的擴(kuò)增，如CD74、RPS14、GPX3、Chr5的TNIP1、CSNK1D、CD7、CYBC1、NARF、FPXK2、Chr17的TBCD，以及Chr19的MED16、CFD、PTBP1（圖2b），與WCH7和TCGA數(shù)據(jù)集的WGS標(biāo)志一致。接下來(lái)，作者比較了惡性細(xì)胞與非惡性細(xì)胞的比例。在LUAD和LUSC中占優(yōu)勢(shì)的惡性細(xì)胞分別是AT2和基底細(xì)胞（圖2c，d），表明AT2和基底細(xì)胞在肺癌異質(zhì)性形成中的重要性。根據(jù)推斷的CNVs，作者將每種細(xì)胞類型分為亞克?。▓D2e，f）。為了進(jìn)一步確定每個(gè)亞克隆的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因和潛在的治療目標(biāo)，作者計(jì)算了具有關(guān)鍵臨床價(jià)值的基因的擴(kuò)增情況，包括EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2和MET。例如，作者發(fā)現(xiàn)在AT2的2號(hào)和7號(hào)亞克?。▓D2g）和AT1細(xì)胞的1號(hào)亞克隆、NE細(xì)胞的5號(hào)亞克隆中，EGFR的擴(kuò)增達(dá)到峰值。這些亞克隆的大部分細(xì)胞來(lái)自LUAD患者，這與AT1可由成熟的AT2細(xì)胞通過(guò)EGFR- KRAS途徑更新的觀點(diǎn)一致（圖2g）。此外，與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性療法相比，靶向治療顯示出更好的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和更高的客觀反應(yīng)率（ORR），并且發(fā)現(xiàn)EGFR擴(kuò)增與TKI療法的敏感性有關(guān)。作者還發(fā)現(xiàn)MET擴(kuò)增在基底細(xì)胞的3號(hào)和6號(hào)亞克隆中富集，這些細(xì)胞主要來(lái)自LUSC患者（圖2h），這與MET作為L(zhǎng)USC的預(yù)后作用可以促進(jìn)腫瘤表型的進(jìn)展相一致。總之，結(jié)果表明AT2和基底細(xì)胞的特定亞克隆可能是肺癌中EGFR和MET的潛在治療目標(biāo)。
確定循環(huán)細(xì)胞組成模塊
為了全面體現(xiàn)惡性細(xì)胞的瘤內(nèi)異質(zhì)性，作者在scRNA-seq中確定了細(xì)胞組成，然后試圖從bulk RNA-seq中發(fā)現(xiàn)大隊(duì)列中反復(fù)出現(xiàn)的細(xì)胞組成模塊。首先根據(jù)scRNA-seq中LUAD和LUSC的所有非免疫細(xì)胞的組成對(duì)樣本進(jìn)行了分級(jí)聚類。值得注意的是，LUAD和LUSC傾向于聚在一起，表明這兩個(gè)亞型有不同的細(xì)胞組成（圖3a）。為了驗(yàn)證這一觀察，作者試圖從大型隊(duì)列中評(píng)估腫瘤和正常肺的RNA-seq的細(xì)胞組成，包括TCGA（n=1116）、WCH RNA-seq（n=49）、東亞人組（n=260）、CHOICE（n=490）和GTEx（n=427）。由于大體積樣品由各種細(xì)胞類型的異質(zhì)混合物組成，作者開(kāi)發(fā)了一個(gè)去卷積工作流程inferCC（根據(jù)scRNA-seq表達(dá)特征推斷細(xì)胞組成）來(lái)評(píng)估不同細(xì)胞類型的相對(duì)比例（圖3b）。作者發(fā)現(xiàn)，盡管LUAD、LUSC和正常肺的大量RNA-seq來(lái)源不同，但細(xì)胞組成高度一致（Pearson相關(guān)性r>0.8，圖3c）。事實(shí)上，細(xì)胞組成可以區(qū)分WCH（圖3d）、TCGA（圖3e）和CHOICE中的LUAD和LUSC樣本，以及東亞隊(duì)列中的LUAD和鄰近組織。接下來(lái)作者通過(guò)去卷積方法的曲線下面積（AUC）分析確認(rèn)了可靠性。基于這些細(xì)胞組成，能夠使用支持向量機(jī)（SVM）對(duì)肺癌亞型進(jìn)行正確分類，準(zhǔn)確率很高（圖3f，AUC=0.89，SD=0.01），表明inferCC解卷的細(xì)胞組成可用于肺癌患者的分類。綜上所述，分析顯示LUAD和LUSC擁有不同的細(xì)胞組成，這在形成其異質(zhì)性方面發(fā)揮了重要作用。作者進(jìn)一步確定，基底是LUAD和LUSC之間異質(zhì)性的主要來(lái)源之一，而成纖維細(xì)胞和NE是區(qū)分兩個(gè)腫瘤亞型和其鄰近組織的關(guān)鍵細(xì)胞類型，表明這些細(xì)胞類型在NSCLC中具有重要意義（圖3g）。接下來(lái)，作者試圖根據(jù)LUAD和LUSC的細(xì)胞組成來(lái)確定其亞組。在LUAD中，確定了四個(gè)組。AT2-high、Fib-high、AT1-high和NE-high（圖3h）。這四個(gè)亞型在TCGA隊(duì)列中得到進(jìn)一步證實(shí)（圖3i）。值得注意的是，在TCGA中，被歸類為Fib-high的患者與LUAD的預(yù)后不良有關(guān)（P = 0.016，對(duì)數(shù)檢驗(yàn)，圖3l）。在LUSC中，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)主要組別：basal-high、fib-high、AT2-high和NE-high（圖3j），并利用TCGA隊(duì)列進(jìn)行了驗(yàn)證（圖3k）。 重要的是，作者發(fā)現(xiàn)AT2-high（P = 0.0043，對(duì)數(shù)檢驗(yàn)，圖3m）可以促成LUSC的不良生存。這一部分的結(jié)果表明，特定的細(xì)胞組成可能對(duì)預(yù)測(cè)肺癌的預(yù)后有重要的潛在價(jià)值。
修飾LUAD和LUSC的細(xì)胞間相互作用
細(xì)胞間相互作用的改變?cè)谀[瘤進(jìn)展中起著重要作用。為了闡明NSCLC兩種亞型中每種配體受體相互作用的重新分布，作者進(jìn)行了細(xì)胞間相互作用（CCI）分析，并根據(jù)CellPhoneDB計(jì)算每種細(xì)胞類型中受體配體的數(shù)量。包括AT2和Fib細(xì)胞在內(nèi)的非免疫細(xì)胞類型的細(xì)胞間相互作用在LUAD和LUSC之間發(fā)生了轉(zhuǎn)變（圖4a）。相比之下，免疫細(xì)胞的細(xì)胞相互作用在兩個(gè)亞型之間沒(méi)有明顯的變化。結(jié)果強(qiáng)調(diào)了免疫和非免疫細(xì)胞以及NSCLC兩個(gè)亞型之間的細(xì)胞相互作用的差異。鑒于LUAD的Fib-high、AT2-high和LUSC的Basal-Fib hybrid與預(yù)后不良有關(guān)，作者接下來(lái)關(guān)注AT2和成纖維細(xì)胞在LUAD和LUSC的CCI。結(jié)果顯示，與鄰近組織相比，LUSC和LUAD的CCI明顯增加（圖4b, c）。此外，GO注釋表明，AT2、Fib和Mφ之間的配體和受體在白細(xì)胞遷移、激活和肽基酪氨酸相關(guān)通路中富集（圖4d，e）。例如，作者發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體TYRO3和GAS6、免疫抑制受體LILRB2和HLA-F之間的受體配體配對(duì)特別發(fā)生在LUSC的AT2細(xì)胞中（圖4f），而AXL和GAS6之間的相互作用在LUAD的成纖維細(xì)胞中觀察到，但在其鄰近組織中沒(méi)有（圖4g），與它們?cè)贜SCLC中的潛在功能一致。事實(shí)上，以前的研究發(fā)現(xiàn)，TYRO3和GAS6可能促進(jìn)Mφ極化為促進(jìn)腫瘤的M2表型，而LILRB2也與在NSCLC中可以促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)的髓細(xì)胞極化為炎癥表型有關(guān)。這一部分的結(jié)果顯示，LUAD和LUSC的CCI增加，一些受體配體配對(duì)可能在NSCLC中發(fā)揮功能作用。
惡性和階段特異性基因改變
為了揭示基因表達(dá)變異與腫瘤內(nèi)/腫瘤間異質(zhì)性之間的關(guān)系，作者對(duì)LUAD和LUSC中每種細(xì)胞類型的惡性和非惡性細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)分析。與非惡性細(xì)胞相比，惡性細(xì)胞中有數(shù)千個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)。值得注意的是，AT2、基底細(xì)胞、NE細(xì)胞在惡性細(xì)胞中具有最高數(shù)量的上調(diào)或下調(diào)基因(圖5a)。為了確定兩種亞型共有的上調(diào)基因，作者比較了不同細(xì)胞類型中亞型特異性和共同DEGs的百分比。例如AT2和NE細(xì)胞的DEGs中只有20%和8.93%的LUAD和LUSC共有基因(圖5b)。作者進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)基于上調(diào)基因的TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。家族特異性腫瘤抑制因子NKX2-1被鑒定為L(zhǎng)UAD中AT2細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子之一(圖5c)，該網(wǎng)絡(luò)揭示了S100A13，一個(gè)參與鈣結(jié)合和細(xì)胞周期進(jìn)程的基因，受NKX2-1的調(diào)控。事實(shí)上，與良性孤立性肺結(jié)節(jié)(BSPN)相比，S100A13在LUAD中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)附近有更高的ATAC-seq峰。與惡性AT2的高表達(dá)相一致(圖5d)。在LUSC的網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)了包括KLF5和MYC在內(nèi)的關(guān)鍵的基底細(xì)胞TF，其在肺癌患者中的擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)與之一致，是早期腫瘤的預(yù)后標(biāo)志。接下來(lái)，作者對(duì)惡性細(xì)胞上調(diào)基因進(jìn)行了GO和DOSE分析。在LUAD中，AT2細(xì)胞富集了來(lái)自未折疊蛋白反應(yīng)、免疫細(xì)胞和mRNA代謝過(guò)程調(diào)控的基因。在LUSC中，基底細(xì)胞富含免疫反應(yīng)、蛋白折疊、I型干擾素、白細(xì)胞和細(xì)胞活化。
為了研究腫瘤階段性的調(diào)節(jié)，作者對(duì)每種細(xì)胞類型進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析（DEG），進(jìn)一步構(gòu)建了AT2（LUAD）和基底（LUSC）細(xì)胞的基因模塊。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在I期患者的細(xì)胞中有許多與腫瘤相關(guān)的基因，包括LUAD的AT2細(xì)胞中的PIGR、AZGP1、BTG2、EGR1和LMO3（圖5e），以及LUSC的基底細(xì)胞中的AQP3、SPHK1、PPT1和PDIA6（圖5f）。最后，作者探討了惡性細(xì)胞中的上調(diào)基因S100A13和LUAD中AT2的階段I上調(diào)基因AZGP1以及LUSC中基底細(xì)胞的PPT1的潛在功能。S100A13是S100鈣結(jié)合蛋白的一個(gè)成員，在細(xì)胞周期進(jìn)展和膜通透性方面發(fā)揮作用。AZGP1在脂質(zhì)動(dòng)員中發(fā)揮重要作用，并有助于惡性腫瘤相關(guān)的惡病質(zhì)，而PPT1編碼的小糖蛋白通過(guò)從半胱氨酸殘基上去除硫酸鹽連接的脂肪?；鴧⑴c脂質(zhì)分解。此外，S100A13（P=7.29e-4，t檢驗(yàn)）、AZGP1（P=6.31e-4，t檢驗(yàn)）和PPT1（P=1.18e-4，t檢驗(yàn)）的過(guò)表達(dá)，顯著增加了肺癌H1299細(xì)胞的增殖（圖5g）。此外，轉(zhuǎn)孔實(shí)驗(yàn)也證實(shí)AZGP1、S100A13和PPT1增強(qiáng)了H1299細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖5h ，j），表明這些基因的致癌作用。綜上所述，研究結(jié)果確定了LUAD和LUSC的轉(zhuǎn)錄組改變，并揭示了AZGP1、S100A13和PPT1基因在腫瘤發(fā)生中的潛在功能，這些基因在早期DEGs中被發(fā)現(xiàn)，表明它們是早期診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物和目標(biāo)。
LUAD中AT2子簇的明顯特征
為了進(jìn)一步了解LUAD中關(guān)鍵AT2細(xì)胞的亞簇，作者重點(diǎn)研究了21465個(gè)惡性AT2細(xì)胞及其5個(gè)亞簇。簇1、2和4的細(xì)胞主要來(lái)自早期(I和II期)肺癌患者，而簇3和5的細(xì)胞主要來(lái)自晚期(III和IV期)患者(圖6a)。為了說(shuō)明AT2細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄軌跡，作者使用URD進(jìn)行了假時(shí)間分析。推斷擬時(shí)間結(jié)果反映280個(gè)細(xì)胞之間的階段(圖6 b, c)。這些結(jié)果符合stage-specific基因模塊(圖5 e), 表明AT2早期和晚期的病人之間的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異。為了評(píng)估每個(gè)亞群的生物學(xué)功能，作者將每個(gè)亞群的標(biāo)記基因與來(lái)自人類肺單細(xì)胞圖譜的標(biāo)記基因進(jìn)行比較，其中11個(gè)基因被分為AT2一般和AT2信號(hào)選擇性(AT2-s)、AT1一般標(biāo)記基因和亞群特異性基因。有趣的是，作者觀察到正常和惡性AT2細(xì)胞之間有一些一致的表達(dá)模式。AT2通用標(biāo)記顯示在所有集群廣泛表達(dá) (圖6 d)。值得注意的是，AT2-信號(hào)通路(AT2-s)基因，包括WNT通路的配體(WNT5A)、調(diào)節(jié)蛋白(CTNNBIP1)共受體(LRP5)和轉(zhuǎn)錄因子(TCF7L2)，據(jù)報(bào)道與罕見(jiàn)的WNT活性AT2細(xì)胞亞群同源，可能是肺泡干細(xì)胞。簇1、2、3和4傾向于AT2信號(hào)基因的高表達(dá)，而簇5中AQP5、AXIN2和GSTA1的表達(dá)最低(圖6d)。在比較簇間的干細(xì)胞得分時(shí)，簇5具有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞比例與其他簇相比相對(duì)較低(圖6e)，這表明不同腫瘤分期的細(xì)胞具有不同的干細(xì)胞潛能的細(xì)胞組成。接下來(lái)，作者比較了這些亞群中預(yù)后生物標(biāo)志物、藥物靶點(diǎn)(圖6f)和可靶向突變(圖6g)的基因表達(dá)水平。它們?cè)诖?中的表達(dá)相對(duì)較高，表明目前的預(yù)后標(biāo)志物和藥物局限于晚期分化細(xì)胞的基因，而不是針對(duì)腫瘤早期的增殖簇。為了研究增殖集群標(biāo)記基因的功能含義，作者評(píng)估了七個(gè)基因，包括一般標(biāo)記（ANXA1），集群1（AQP5，ATF3，AZGP1和CHI3L1），集群2（SPINK1）和集群4（EFF1A2）。ANXA1在所有集群中都有高表達(dá)。作者通過(guò)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ANXA1蛋白在LUAD腫瘤和正常組織中的表達(dá)，ANXA1的過(guò)表達(dá)表明它可能通過(guò)增強(qiáng)增殖來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。更重要的是，與正常對(duì)照組相比，AQP5的免疫熒光染色以及AT2標(biāo)記物SPB在LUAD腫瘤組織的AT2細(xì)胞中上調(diào)（圖6h），并且AQP5在肺癌H1299細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了增殖（圖 6i，P=1.13e-4，t檢驗(yàn)），高水平的AQP5與較好的預(yù)后（圖6j，P=0.045）和肺癌細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，表明AQP5有促進(jìn)腫瘤的作用（圖6k，l），與它通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用一致。根據(jù)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，集群1（ATF3、AZGP1和CHI3L1）、集群2（SPINK1）和集群4（EFF1A2）的其他標(biāo)記物也被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。總之，作者在惡性AT2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一些具有明顯特征的簇，其中一些類似于增殖細(xì)胞（簇1-4），而另一些（簇5）則傾向于第三期患者的分化，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的六個(gè)標(biāo)記基因可能具有潛在的臨床價(jià)值。
LUSC基底細(xì)胞分化亞群
基于細(xì)胞模塊的分析，基底細(xì)胞被證明是LUSC的關(guān)鍵細(xì)胞類型之一。為了確定基底細(xì)胞亞群的特征，作者集中研究了8202個(gè)惡性細(xì)胞，這些細(xì)胞可分為七個(gè)群。聚類1、3、4和7主要由來(lái)自早期（I期和II期）患者的基底細(xì)胞組成，而聚類5和6是不同階段的混合體，聚類2則全部來(lái)自III期（圖7a）。在偽時(shí)間分析中，來(lái)自II期的細(xì)胞與I期和III期的細(xì)胞有偏差（圖7b，c），這與II期有最多的階段性特異基因相一致（圖5f）。為了了解每個(gè)集群的生物學(xué)特性，作者將集群特異性基因（圖7d）與人類肺細(xì)胞圖譜中的基因進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基底的一般標(biāo)志物在所有集群中廣泛表達(dá)，而近端基底的標(biāo)志物（Bas-px）在集群7中高度表達(dá)，分化基底的標(biāo)志物（Bas-d）在集群3中選擇性表達(dá)（圖7d）。值得注意的是，集群4選擇性地表達(dá)了增殖基底（Bas-p）的標(biāo)志物，包括MKI67、TOP2A、PBK和GTSE1。作者進(jìn)一步利用干性和細(xì)胞循環(huán)得分，發(fā)現(xiàn)第4簇的干性得分最高，主要被歸類為循環(huán)細(xì)胞（圖7e，f），表明該簇可能具有增殖細(xì)胞的特征。最后，作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究了集群4的特異性KPNA2（karyopherin alpha 2）和集群7的PPT1。與正常肺組織相比，通過(guò)免疫熒光染色觀察到腫瘤組織中KPNA2蛋白的表達(dá)增加（圖7g）。綜上所述，這部分結(jié)果揭示了類似于正常肺細(xì)胞亞群的惡性細(xì)胞群和一個(gè)（群4）在惡性基底細(xì)胞中具有干性增殖的特征，KPNA2可能促進(jìn)LUSC的腫瘤增殖。
三. 總結(jié)
綜上所述，本研究結(jié)合多組學(xué)分析建立了肺腫瘤圖譜，并廣泛研究了LUAD和LUSC之間的異質(zhì)性變化，為了解肺癌亞型之間腫瘤進(jìn)展的獨(dú)特機(jī)制提供了有價(jià)值的資源。為肺癌的早期診斷和治療提供了藍(lán)圖。
參考文獻(xiàn)
Zhang, L., et al., Integrated single-cell RNA sequencing analysis reveals distinct cellular and transcriptional modules associated with survival in lung cancer. Signal Transduct Target Ther, 2022. 7(1): p. 9.
