掃碼聯(lián)系客服
手里只有十幾個(gè)樣本能躥出什么大活兒？今天想通過(guò)一篇文章來(lái)說(shuō)明，在沒有很多的樣本的情況下，通過(guò)一定的方式方法也可以做出好文章。這篇文章只有19個(gè)腫瘤樣本，但是卻能發(fā)到Cancer Research（IF:13.312）上，到底是有什么魔力？
題目：Integrative Single-Cell Analysis Reveals Transcriptional and Epigenetic Regulatory Features of Clear Cell Renal Cell Carcinoma 綜合單細(xì)胞分析揭示腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)調(diào)控特征
背景
腎臟癌癥是泌尿系統(tǒng)最常見的癌癥之一，癌癥的發(fā)病率每年都在增加。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）是最常見的癌癥類型，約占所有原發(fā)病例的60%至80%。近年來(lái)，由于對(duì)ccRCC的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的廣泛深入研究，以及對(duì)其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)提高，ccRCC靶向治療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療取得了一些突破和巨大進(jìn)展。然而，總體無(wú)病生存率的提高仍然非常有限；晚期腎細(xì)胞癌（RCC）仍然具有較高的死亡率。
考慮到ccRCC的瘤內(nèi)異質(zhì)性，腫瘤進(jìn)化為具有獨(dú)特基因組特征的大量細(xì)胞。因此，近年來(lái)，許多ccRCC的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）研究揭示了單細(xì)胞水平上腫瘤細(xì)胞、腫瘤特異性標(biāo)志物和腫瘤免疫微環(huán)境的特征。然而，以前的研究大多集中在單細(xì)胞RNA水平上，忽略了ccRCC的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。
腫瘤細(xì)胞或個(gè)體之間的變異是生活的一個(gè)常見特征，也稱為腫瘤異質(zhì)性。使用測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)的單細(xì)胞分析（scATAC-seq）是一種了解相同DNA序列變異的基本機(jī)制的穩(wěn)健方法。然而，很少有scATAC-seq研究關(guān)注腫瘤細(xì)胞，尤其是ccRCC。在這項(xiàng)研究中，作者對(duì)19個(gè)ccRCC樣本進(jìn)行了單細(xì)胞多組學(xué)研究。通過(guò)整合19個(gè)ccRCC樣本（總計(jì)約164000個(gè)細(xì)胞）的scATAC-seq和scRNA-seq，結(jié)合全外顯子組測(cè)序（WES），揭示了ccRCC的表觀遺傳學(xué)調(diào)控特征。
結(jié)果
1、人類ccRCC轉(zhuǎn)錄組景觀的單細(xì)胞多組學(xué)研究
在這項(xiàng)研究中，作者收集了19名患有局限性ccRCC患者的新鮮手術(shù)切除物分別進(jìn)行scRNA-seq和scATAC-seq（圖1A）。根據(jù)先前研究中標(biāo)記基因的表達(dá)和細(xì)胞注釋，將ccRCC分為22種獨(dú)立的細(xì)胞類型，包括四種腫瘤細(xì)胞亞型（ccRCC1、ccRCC2、ccRCRC3和ccRCC4）、四種內(nèi)皮細(xì)胞亞型，（Endo細(xì)胞1、Endo細(xì)胞2、Endo細(xì)胞3和Endo細(xì)胞4）等（圖1B和C）。在ccRCC中，T細(xì)胞數(shù)量最多，其次是腫瘤細(xì)胞（圖1D）。大多數(shù)細(xì)胞類型來(lái)源于每個(gè)樣本，而腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的個(gè)體差異更為明顯（圖1E）。例如，腫瘤細(xì)胞（ccRCC 4）僅來(lái)源于患者RCC84，Endo細(xì)胞4僅來(lái)源于三個(gè)個(gè)體。與先前的研究一致，免疫細(xì)胞，特別是T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）的廣泛浸潤(rùn)，表征了ccRCC的免疫微環(huán)境（圖1B和D），CD8+T細(xì)胞在ccRCC組織中的浸潤(rùn)更為顯著。
2、scRNA-seq對(duì)腫瘤細(xì)胞分子亞型的表征
考慮到ccRCC的遺傳易感性，作者對(duì)所有ccRCC樣本進(jìn)行了WES，以了解個(gè)體之間的DNA變異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些常見突變基因的變異與先前研究中發(fā)現(xiàn)的變異相似（圖2A）。將腫瘤細(xì)胞分為VHL、CA9、KRT14和CD24突變或非突變組，并比較它們的基因表達(dá)差異（圖2B–E）。發(fā)現(xiàn)突變和非突變腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)非常相似，Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.98（圖2B–E）。因此，這表明ccRCC中的單個(gè)突變基因并沒有引起腫瘤細(xì)胞所有基因表達(dá)的巨大變化。
根據(jù)基因表達(dá)特征，腫瘤細(xì)胞通過(guò)scRNA-seq無(wú)偏地聚集為四種細(xì)胞亞型（ccRCC1、ccRCC2、ccRCRC3和ccRCC4）（圖3A和B）。在不同的腫瘤細(xì)胞亞型中具有明顯的基因表達(dá)差異（圖3C）。lncRNA并且在這項(xiàng)研究中首次發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1通過(guò)scRNA-seq在ccRCC的特定細(xì)胞亞型中高表達(dá)。作者進(jìn)行CNV分析發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞亞型中存在不同的CNV特征（圖3D），這可能是由腫瘤細(xì)胞的克隆或亞克隆引起的。因此，可以使用scRNA-seq結(jié)果來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞在root狀態(tài)下的情況以及腫瘤細(xì)胞進(jìn)化的方向。計(jì)算每種腫瘤細(xì)胞類型的DEG發(fā)現(xiàn)，ccRCC1、ccRCC2和ccRCC3中的大多數(shù)DEG表明存活率為陽(yáng)性，而ccRCC4中的更多DEG表明預(yù)后不良，這與之前的三種細(xì)胞亞型相比是顯著的（圖3E）。
3、scRNA-seq揭示了ccRCC免疫微環(huán)境的特征
在這項(xiàng)研究中，免疫細(xì)胞在ccRCC組織中占很高的比例，約占所有細(xì)胞的64.7%（圖1D），可分為13種細(xì)胞類型。在腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞的相互作用非常密切，尤其是TAM1、樹突狀細(xì)胞和增殖性CD8+T細(xì)胞。一些配體-受體對(duì)，如CD74-MIF、CD74-COPA和CD74-APP，在TAM和其他免疫細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用（圖4）。
4、ccRCC中單細(xì)胞染色質(zhì)可及性景觀的構(gòu)建
在本研究中，對(duì)19 ccRCC樣本進(jìn)行scATAC-seq。將這些細(xì)胞分為29種不同的細(xì)胞類型，并確定了每種細(xì)胞類型的樣本來(lái)源（圖5A和B）。在這里，作者計(jì)算了腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、CAF、免疫細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的標(biāo)記基因活性評(píng)分（圖5C）。隨后，分析細(xì)胞類型特異性峰，然后鑒定這些峰的相應(yīng)基因區(qū)域（圖5D）。相對(duì)可靠地定義了ccRCC中的29種不同細(xì)胞類型（圖5A）。
5、scATAC-seq揭示了ccRCC腫瘤細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)節(jié)的特征
作者通過(guò)使用scATAC-seq鑒定了所有細(xì)胞類型的可訪問(wèn)染色質(zhì)區(qū)域，（圖6A）。這些可訪問(wèn)的染色質(zhì)區(qū)域也表明它們的調(diào)節(jié)過(guò)程不是細(xì)胞類型特異性的。因此，可以通過(guò)鑒定細(xì)胞類型特異性的可訪問(wèn)染色質(zhì)區(qū)域來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型特異的調(diào)節(jié)過(guò)程。此外，scATAC-seq結(jié)果顯示，非腫瘤細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和CAF）的染色質(zhì)可及性在個(gè)體之間是一致的（圖6B）。根據(jù)染色質(zhì)的可及性，腫瘤細(xì)胞可分為16種細(xì)胞亞型（圖6C）。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞亞型來(lái)源于單個(gè)ccRCC樣本（圖6C）。與先前對(duì)基底細(xì)胞癌的研究類似，ccRCC中腫瘤細(xì)胞的染色質(zhì)可及性存在顯著的個(gè)體間異質(zhì)性。
為了研究腫瘤細(xì)胞中染色質(zhì)調(diào)節(jié)的特征，通過(guò)使用scATAC-seq鑒定了16種腫瘤細(xì)胞亞型和每個(gè)細(xì)胞亞型的染色質(zhì)可及性區(qū)域（圖6C）。發(fā)現(xiàn)CA9和KRT14在ccRCC細(xì)胞中充當(dāng)可訪問(wèn)區(qū)域的標(biāo)記，其在每個(gè)腫瘤細(xì)胞亞型中維持染色質(zhì)可訪問(wèn)性（圖6D和E）。這可能表明ccRCC在DNA水平上具有遺傳傾向。
6、scATAC-seq揭示了lnc-RNA在體外促進(jìn)cc腎細(xì)胞癌侵襲和遷移中的生物學(xué)功能
有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)了四種lncRNA（RP11-661C8.2、CTB-32H22.1、CTB-164N12.1和RP11-267A15.1），它們可通過(guò)scATAC-seq特異性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞亞型（圖7A），且都有一個(gè)位于5號(hào)染色體上的共同特征（圖7A）?？紤]到ccRCC具有5號(hào)染色體拷貝數(shù)增加的特征，假設(shè)這些lncRNA可能在ccRCC中發(fā)揮特定的調(diào)節(jié)作用。因此，選擇了兩種lncRNA（RP11-661C8.2和CTB-164N12.1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證這些lncRNA的生物學(xué)功能。
ASO處理后ccRCC細(xì)胞系的增殖活性顯著降低（圖7B和C）。隨后進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，NC組的傷口愈合優(yōu)于ASO治療組（圖7D-F）。還進(jìn)行了transwell測(cè)定，在ASO治療后，786-O和Caki-2的遷移顯著減少（圖7G和H）。此外，ccRCC細(xì)胞系中E-鈣粘蛋白的表達(dá)顯著增加（圖7I）。這些結(jié)果證實(shí)了RP11-661C8.2和CTB-164N12.1的功能，它們?cè)隗w外促進(jìn)了ccRCC的侵襲和遷移。
此外，整合蛋白質(zhì)質(zhì)譜和scRNA-seq結(jié)果（圖7J），將蛋白質(zhì)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)的緊密結(jié)合的蛋白映射到scRNA-seq鑒定的細(xì)胞類型中的基因表達(dá)。結(jié)果表明RP11-661C8.2和CTB-164N12.1的調(diào)節(jié)功能是細(xì)胞類型特異性的，主要調(diào)節(jié)CAF、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
7、scATAC-seq揭示了ccRCC中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
作者基于scATAC-seq鑒定了特異性轉(zhuǎn)錄因子（圖8A）。通過(guò)富集每種細(xì)胞類型中前10個(gè)最重要的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子具有細(xì)胞類型特異性，特別是在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間（圖8B）。
8、整合scATAC-seq和scRNA-seq分析揭示了腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)特征
在本研究中，建立了包括scATAC-seq和scRNA-seq之間的所有細(xì)胞類型的對(duì)應(yīng)關(guān)系的圖譜，分別展示所有細(xì)胞類型和腫瘤細(xì)胞類型（圖9A和B）。圖9C展示了每個(gè)scATAC-seq簇的腫瘤細(xì)胞的比例，這些腫瘤細(xì)胞用從scRNA-seq簇轉(zhuǎn)移的簇標(biāo)記物進(jìn)行注釋，這意味著染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如由ccRCC11的可接近染色質(zhì)區(qū)域調(diào)節(jié)的ccRCC2的基因表達(dá)特征是準(zhǔn)確的（圖9D）。但ccRCC1的調(diào)節(jié)特征是復(fù)雜的，包括15種scATAC-seq腫瘤細(xì)胞亞型的調(diào)節(jié)特征（圖9E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，ccRCC腫瘤細(xì)胞的可及染色質(zhì)區(qū)域存在個(gè)體差異，并且存在共同的調(diào)節(jié)區(qū)域。
小結(jié)
整體來(lái)說(shuō)，本研究整合了scATAC-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)，使用scATAC-seq和scRNA-seq對(duì)ccRCC中的基因表達(dá)和DNA調(diào)控進(jìn)行綜合分析，揭示了ccRCC在單細(xì)胞水平上的DNA調(diào)控程序，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的lncRNA，這將為ccRCC治療提供新的見解。但未來(lái)可能需要開發(fā)更多更強(qiáng)大的scATAC-seq數(shù)據(jù)分析方法。
發(fā)現(xiàn)沒有，即使是在小樣本量的研究中，亮點(diǎn)之處在于數(shù)據(jù)整合，在于精而不在于多，搞明白亮點(diǎn)，小隊(duì)列也可以發(fā)大文章！
多組學(xué)研究思路
二維碼
