單細胞分析如何研究細胞動態(tài)變化？

文章簡介：

這篇文章發(fā)表在期刊: Embo Reports，期刊在最近一年的影響因子: 8.807比上一年增加了 1.31。這篇文章用 snRNA-seq 和 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，構(gòu)建人脊髓不同發(fā)育時期的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，得到完整的神經(jīng)元數(shù)據(jù)集，揭示了不同時期人脊髓神經(jīng)細胞的發(fā)育時期特性和遺傳異質(zhì)性；鑒定了不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組特征，同時揭示了不同發(fā)育時期神經(jīng)元的構(gòu)成變化。

背景知識：

脊髓是一種高度組織化的組織，由三種不同的神經(jīng)細胞組成：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。同時，脊髓是外周系統(tǒng)與大腦間信號傳遞的橋梁。脊髓背角介導著外周感受信號，而腹側(cè)對于運動功能的執(zhí)行至關(guān)重要，同時也是低級反射的中樞。作為一種高度有序的中樞組織，脊髓由多種不同的細胞類型有序發(fā)育形成。雖然脊髓的發(fā)育在嚙齒類動物中已進行了一系列的研究，但對人類脊髓發(fā)育過程了解較少。
一些單細胞測序（scRNA-seq）研究脊髓發(fā)育已經(jīng)在模型系統(tǒng)中進行；然而，由于這些研究大多集中于神經(jīng)發(fā)生，膠質(zhì)細胞發(fā)育的單細胞轉(zhuǎn)錄組學信息仍然缺乏，尤其是星形膠質(zhì)細胞。膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)的中樞組成部分。最近的研究指出膠質(zhì)細胞在發(fā)育和成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用越來越廣泛。單細胞分析為人類膠質(zhì)細胞的多樣性和發(fā)展提供更多的信息。此外，與模式脊椎動物相比，人類胚胎的妊娠期較長，神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)發(fā)生的時間較長。這種延長的發(fā)育有利于分析神經(jīng)細胞亞型及其在成熟過程中的過渡狀態(tài)?；诖耍瑢Πl(fā)育中的人類脊髓進行了高通量單細胞核 RNA 測序（snRNA-seq）和單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）研究。

結(jié)果解讀：

• 人脊髓發(fā)育過程中的snRNA-seq和scRNA-seq

作者從GW7到GW23獲取了脊髓樣本。GW是從女性最后一次月經(jīng)期的第一天開始測量的。對樣品進行snRNA-seq和/或scRNA-seq處理(Fig 1A )。通過UMAP將數(shù)據(jù)投射到二維，并基于差異表達基因(DEG)和基因本體論(GO)分析確定主要細胞類型。一共鑒定出八大類：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、室管膜細胞(包括頂板和底板細胞)、神經(jīng)前體細胞、小膠質(zhì)細胞、腦膜細胞和血管細胞(Fig 1B )。

• 膠質(zhì)細胞分化始于GW8左右，腦室區(qū)域特定化發(fā)生在GW10左右

神經(jīng)干細胞具有增殖和分化為神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞的能力。作者研究了個體樣本內(nèi)的分化軌跡(Fig 1C)。在GW14后，NPC簇失去了與神經(jīng)元群的聯(lián)系，但與星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞簇的聯(lián)系仍然存在。在GW22之后，大多數(shù)分裂的NPC傾向于與少突膠質(zhì)細胞群相連(Fig 1C)。免疫熒光分析還顯示，RBFOX3陽性神經(jīng)細胞是GW7脊髓的主要細胞類型。從GW10開始，GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞呈放射狀膠質(zhì)細胞形態(tài)，這有助于膠質(zhì)細胞遷移。脊髓在GW23左右達到成熟形態(tài)(Fig 1D)。總的來說，這些結(jié)果反映了膠質(zhì)細胞群體在發(fā)育過程中的動態(tài)產(chǎn)生。

• 解析神經(jīng)元發(fā)育情況

為了深入了解神經(jīng)元的分化過程，作者對從GW7到GW11的基于NPC和神經(jīng)細胞的神經(jīng)元譜系進行了亞群分析。通過表達螺旋-環(huán)-螺旋和成對的盒轉(zhuǎn)錄因子如HES6、DLL1和PAX3來鑒定神經(jīng)前體細胞。興奮性神經(jīng)元(EXC)、抑制性神經(jīng)元(INH)和運動神經(jīng)元(MN)分別通過SLC17A6、GAD1和MNX1的表達來區(qū)分。熱圖可視化顯示了簇中排名前10位的差異基因(Fig 2A)。差異表達數(shù)據(jù)的GO富集分析表明，神經(jīng)元前體細胞富集在翻譯、起始和膜靶向蛋白上，而未成熟背部神經(jīng)元富集在神經(jīng)元分化和突觸信號上(Fig 2B)。作者觀察到，有絲分裂神經(jīng)元前體簇強烈表達了背側(cè)神經(jīng)前體基因PAX3，而腹側(cè)基因NKX6-2在該人群中的表達較少。免疫組織化學染色證實GW7后腦室區(qū)背側(cè)充滿神經(jīng)前體細胞(Fig 2C)。接下來，作者確定每個發(fā)育時間點每個細胞群體的相對比例，以估計發(fā)育趨勢(Fig 2D)。雖然在GW7有腹側(cè)神經(jīng)元發(fā)育的跡象，但作者的數(shù)據(jù)表明背側(cè)神經(jīng)元的發(fā)育是這一時期的主要事件(GW7-GW11)。對GW10 (Fig 2E)的分析還表明，神經(jīng)元分化途徑富集到神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如POU4F1和TLX3。

• 膠質(zhì)細胞發(fā)育和表達區(qū)域特異性EGFR的膠質(zhì)細胞

為了評價神經(jīng)細胞的多樣性并剖析其在人脊髓中的發(fā)育，作者整合了從GW7到GW23的神經(jīng)細胞數(shù)據(jù)集。整合導致了神經(jīng)細胞類型的細胞轉(zhuǎn)錄多樣性(Fig 3A和C)。作者發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞(0、3、7和14群，包括早期發(fā)育階段的祖細胞)在GW20達到最高比例(33.5%)，少突膠質(zhì)細胞(4、6、8和11群)從GW8開始增加，到GW23達到51% (Fig 3B)，DEGs的GO富集分析表明，第0簇富含神經(jīng)前體細胞增殖和膠質(zhì)細胞分化相關(guān)基因，第3簇富含軸突發(fā)生和神經(jīng)元遷移相關(guān)基因，第7簇富含纖毛組裝和纖毛組織，第14簇富含膠質(zhì)細胞發(fā)育和星形膠質(zhì)細胞分化相關(guān)基因(Fig 3D)。

作者注意到第14和0簇是由所有妊娠階段(GW7-GW23)的細胞組成的，而第3和第7簇是由只有在GW11之后才出現(xiàn)的細胞組成的。這種細胞組成的差異表明：14和0簇含有膠質(zhì)分化前出現(xiàn)的祖細胞。對來自GW7的14和0簇的GO富集分析表明，14簇富含與脊髓發(fā)育和神經(jīng)元命運commitment (Fig 4A and B)。第0簇富含膠質(zhì)細胞命運commitment基因(如DAAM2、FAM189A2和ID4)，并在GW7出現(xiàn)分化停滯狀態(tài)(Fig 4A and B)。因此，作者的結(jié)果表明，在GW7，第14簇細胞是神經(jīng)祖細胞，而第0簇代表靜止的膠質(zhì)前體細胞。進一步分析表明，第14簇的細胞在GW11之后逐漸獲得星形膠質(zhì)細胞的表達譜。為了說明這一轉(zhuǎn)換過程，作者構(gòu)建了一個顯示細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程的單細胞軌跡。男性標本從神經(jīng)發(fā)生后期到膠質(zhì)發(fā)生階段的細胞按發(fā)育階段形成連續(xù)的直線軌跡，代表了EGFR⁺膠質(zhì)細胞的過渡過程(Fig 4C)。結(jié)果顯示，DLL1在GW18后表達下降，隨后保持在相對較低的水平。與此同時，在GW14之后，作者觀察到調(diào)節(jié)神經(jīng)前體分化和新生神經(jīng)元存活的MIAT表達的減少。星形膠質(zhì)細胞相關(guān)基因FAM189A2、GFAP和AQP4的表達從神經(jīng)發(fā)生晚期開始持續(xù)增加(GW11) (Figs 4D)。軌跡分析結(jié)果與綜合分析結(jié)果一致，表明EGFR⁺細胞簇(共表達EGFR、DLL1和HES6)主要與星形膠質(zhì)細胞譜系有關(guān)。接下來，作者根據(jù)潛在的受體-配體對相互作用來預(yù)測不同類型神經(jīng)細胞之間的細胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。這一分析表明EGFR⁺細胞與其他類型的膠質(zhì)細胞(即星形膠質(zhì)細胞、室管膜細胞、NPC、OPC和少突膠質(zhì)細胞)之間的相互作用是通過Delta-Notch配體受體和EGFR信號通路實現(xiàn)的(Fig 4E)。

為了進一步研究EGFR表達的細胞，作者對GW7到GW23的脊髓樣本進行了免疫染色。作者發(fā)現(xiàn)EGFR⁺細胞在GW7的豐度很低，但在GW11左右急劇增加。此外，隨著時間的推移，這些細胞的形態(tài)也發(fā)生了變化。作者還注意到EGFR⁺細胞的分布具有位置特異性(Fig 5A和B)。在GW11時，在腦室?guī)У谋硞?cè)和腹側(cè)都觀察到了大量的EGFR⁺細胞。背側(cè)EGFR⁺細胞具有典型的放射狀膠質(zhì)細胞形態(tài)，包括從腹部區(qū)延伸到軟膜表面的單個細小突起，可以用GFAP進行雙重標記(Fig 5D)。同時，在腹側(cè)EGFR⁺細胞群中觀察到EGFR和OLIG2的共定位(Figs 6A and B)，與作者的測序數(shù)據(jù)一致。在GW11scRNA-seq數(shù)據(jù)中，EGFR⁺簇表現(xiàn)出明顯的表達模式：大多數(shù)EGFR⁺PAX3⁺細胞不表達OLIG2，而在PAX3陰性EGFR⁺細胞中檢測到OLIG2表達(Fig 5C)。作者觀察到表皮生長因子受體與星形膠質(zhì)細胞系標記物SOX9的共表達和少突膠質(zhì)細胞系標記物OLIG2。表明EGFR⁺膠質(zhì)細胞是一種既可分化為星形膠質(zhì)細胞又可分化為少突膠質(zhì)細胞的過渡狀態(tài)(Fig 6C and D)。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，一群表達EGFR的過渡性膠質(zhì)細胞起源于神經(jīng)元前體細胞，并通過中間階段逐漸轉(zhuǎn)化為星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞系。這些細胞可以通過受體-配體的相互作用來調(diào)節(jié)膠質(zhì)形成。值得注意的是，作者的結(jié)果表明，在發(fā)育過程中，表達EGFR的過渡性膠質(zhì)細胞以位置特異性的方式分布，背側(cè)EGFR⁺細胞主要集中在背角區(qū)域。

全文小結(jié)：

總體而言，作者已經(jīng)勾勒出人類脊髓神經(jīng)發(fā)育的圖景，涵蓋了從神經(jīng)元產(chǎn)生到星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞分化的時期。不同發(fā)育階段的神經(jīng)細胞類型的轉(zhuǎn)錄組特征是在單細胞分辨率下定義的。作者的研究提供了對人類脊髓發(fā)育的基本見解，可能有助于實現(xiàn)細胞治療方法來治療脊髓疾病。

參考文獻：Zhang, Q., Wu, X., Fan, Y., Jiang, P., Zhao, Y., Yang, Y., . . . Dai, J. (2021). Single-cell analysis reveals dynamic changes of neural cells in developing human spinal cord. EMBO Rep, 22(11), e52728. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34605607. doi:10.15252/embr.202152728