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Molecular Subtypes Based on Genomic and Transcriptomic Features Correlate with the Responsiveness to Immune Checkpoint Inhibitors in Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma
轉(zhuǎn)移性透明細(xì)胞腎癌中基于基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征的分子亞型與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)答率相關(guān)
一．研究背景
免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs），如程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）阻斷劑，已被證明是治療多種癌癥類型的有效藥物。盡管腎細(xì)胞癌（RCC）的腫瘤突變負(fù)荷較低，但它具有獨(dú)特的免疫學(xué)特征，包括高免疫浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的增加。在這種情況下，最近的III期臨床試驗(yàn)，如CheckMate 025、CheckMate 214和KEYNOTE 426，表明與酪氨酸激酶抑制劑相比，基于ICIs的方案顯著改善了患者的生存率，尤其是在晚期透明細(xì)胞癌（ccRCC）。盡管ICIs是目前治療轉(zhuǎn)移性ccRCC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但在多個(gè)臨床試驗(yàn)中，40–60%的患者仍然對(duì)ICIs具有內(nèi)在的耐藥性。因此，識(shí)別能夠預(yù)測(cè)ICIs應(yīng)答者或非應(yīng)答者的生物標(biāo)記物具有極其重要的意義。雖然PD-L1表達(dá)是預(yù)測(cè)不同類型惡性腫瘤對(duì)ICIs反應(yīng)性的常規(guī)生物標(biāo)記物，但ccRCC的數(shù)據(jù)存在異質(zhì)性，PD-L1表達(dá)的預(yù)測(cè)價(jià)值尚不具有臨床實(shí)用性。與其他實(shí)體瘤相比，腫瘤突變負(fù)荷和新抗原負(fù)荷是ICIs治療的常用預(yù)測(cè)因子，但與晚期ccRCC對(duì)PD-1阻斷的臨床反應(yīng)無(wú)關(guān)。此外，在接受抗PD-1治療的ccRCC患者中，根據(jù)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)模式，未發(fā)現(xiàn)生存差異。最近，幾項(xiàng)研究報(bào)告，在ccRCC中常見的PBAF復(fù)合基因PBRM1的功能喪失（LOF）突變與ICIs更好的臨床益處（CB）相關(guān)。在這種情況下，全面了解ICIs治療的ccRCC患者PBRM1突變的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)一種新的生物標(biāo)記物以及幫助預(yù)測(cè)哪些患者最有可能從ICIs治療中獲益至關(guān)重要。
二．研究方法
在這里，該研究對(duì)ICIs治療的轉(zhuǎn)移性ccRCC患者進(jìn)行了靶向測(cè)序（n=60）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（WTS）（n=61）。通過(guò)整合CheckMate 025試驗(yàn)的WTS數(shù)據(jù)，獲得了共177個(gè)樣本腫瘤的WTS數(shù)據(jù)，并最終確定了三種分子亞型，它們具有不同的分子表型和PBRM1突變頻率。亞型1和3中的患者在ICIs治療后表現(xiàn)出更差的反應(yīng)和生存率，較低的PBRM1突變和較差的血管生成，但免疫功能豐富，細(xì)胞周期豐富。值得注意的是，亞型2中的患者在ICIs治療后表現(xiàn)出更好的反應(yīng)和存活率，PBRM1突變和代謝程序豐富以及較低的耗竭免疫表型。對(duì)亞型2的進(jìn)一步分析表明，GATM（甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）作為一種與PBRM1突變相關(guān)的新基因，并揭示了其在減少ccRCC腫瘤增殖和抑制ccRCC腫瘤遷移方面發(fā)揮關(guān)鍵作用?？傊?，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)ICIs治療的轉(zhuǎn)移性ccRCC具有不同的基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。并且還發(fā)現(xiàn)，新基因GATM可能是一種潛在的ccRCC腫瘤抑制因子，可能與ICIs治療轉(zhuǎn)移性ccRCC的療效相關(guān)。
三．研究結(jié)果
1、ICIs治療的ccRCC患者的基因組改變特征
為了評(píng)估經(jīng)ICIs治療的轉(zhuǎn)移性ccRCC（n=60）患者的基因組圖譜，該研究集中于靶向測(cè)序數(shù)據(jù)，以確定復(fù)發(fā)性突變基因，并發(fā)現(xiàn)17個(gè)復(fù)發(fā)性改變的基因。該隊(duì)列中最常見的改變基因是VHL（n=34,56.7%）、PBRM1（n=18,30.0%）、SETD2（n=16,26.7%）和BAP1（n=12,20.0%），它們通常與之前報(bào)道的ccRCC常見突變基因相似（圖1A）。接下來(lái)，當(dāng)對(duì)臨床受益（CB）組和非臨床受益（NCB）組之間的基因特異性改變進(jìn)行比較時(shí)，CB組中17個(gè)復(fù)發(fā)性改變基因中只有PBRM1突變顯著富集（圖1B）。正如所料，與PBRM1野生型患者相比，PBRM1突變患者的總生存期（OS）顯著延長(zhǎng)（圖1C）。
2. ICIs治療的ccRCC患者的分子亞型特征
為了深入對(duì)ICIs治療的轉(zhuǎn)移性ccRCC的分子表型的理解，基于與PBRM1突變和PBRM1 LOF相關(guān)的四個(gè)特征進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，并在177名患者中確定了三種分子亞型（圖2）。亞型1（n=64，36%）患者的特征是，適度表達(dá)與PBRM1突變相關(guān)上調(diào)和下調(diào)的基因，血管生成相對(duì)較低，免疫調(diào)節(jié)特征混合。有趣的是，與亞型1和亞型3相比，亞型2（n=75，42%）患者的特征是與PBRM1突變相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)基因的表達(dá)模式一致，血管生成的表達(dá)相對(duì)較高，免疫調(diào)節(jié)信號(hào)的表達(dá)相對(duì)較低，PBRM1的突變率較高。亞型3（n=38，22%）患者的特征是與PBRM1突變相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)基因的反向表達(dá)，血管生成的中度表達(dá)，以及較高免疫調(diào)節(jié)信號(hào)的富集（圖2）。通過(guò)整合該研究隊(duì)列的數(shù)據(jù)和CheckMate 025數(shù)據(jù)中的復(fù)發(fā)突變基因，進(jìn)一步描述了六種常見突變基因的患病率，并發(fā)現(xiàn)亞型2（圖2）患者中VHL（n=36,48%）、PBRM1（n=44,72%）和SETD2（n=28,57%）等改變的患病率高于其他兩種亞型患者。接下來(lái)，為了評(píng)估與這些分子亞型相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)特征，對(duì)每個(gè)亞型進(jìn)行兩兩比較。首先，亞型1在細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)和細(xì)胞發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程中富集. 其次，具有高比例PBRM1突變的亞型2上調(diào)代謝過(guò)程相關(guān)通路. 最后，亞型3特異上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)和免疫反應(yīng)的通路（圖2）。
3.亞型2與更高的代謝過(guò)程和較低的耗竭免疫類型有關(guān)
為了評(píng)估每個(gè)亞型的預(yù)后相關(guān)性，根據(jù)每個(gè)亞型比較OS。值得注意的是，與亞型1和3相比，亞型2與OS顯著相關(guān)（圖3A）。為了進(jìn)一步了解生存結(jié)果的分子機(jī)制，通過(guò)在每個(gè)亞型中使用Hallmark基因集進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）和單樣本GSEA（ssGSEA）來(lái)探索轉(zhuǎn)錄組通路差異?？偟膩?lái)說(shuō)，18個(gè)基因集，包括炎癥反應(yīng)、氧化磷酸化和E2F靶通路，在每個(gè)亞型中都被激活（圖3B）。亞型1和亞型3中免疫相關(guān)通路（炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體和IL6-JAK-STAT3）均激活。亞型3特異激活細(xì)胞周期進(jìn)展通路（G2M檢查點(diǎn)、E2F靶點(diǎn)和有絲分裂）而比亞型1和2預(yù)后更加差。然而，在亞型2患者中，代謝（氧化磷酸化、脂肪酸代謝和脂肪生成）、缺氧和活性氧通路被激活。
為了進(jìn)一步評(píng)估每個(gè)亞型的免疫相關(guān)特征，使用CIBERSORTx反卷積算法分析免疫細(xì)胞比例，根據(jù)分子亞型，未觀察到細(xì)胞類型的顯著差異（圖3C）。有趣的是，亞型3的CD8 T細(xì)胞比例較高，這與免疫治療的作用方式有關(guān)（圖3C）。這一結(jié)果可能與亞型3患者較高的免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)（圖2）。鑒于意外發(fā)現(xiàn)PBRM1高突變率的亞型2與CD8 T細(xì)胞的比例無(wú)關(guān)，我們研究了不同免疫亞型的腫瘤內(nèi)在特征是否會(huì)影響ICIs的反應(yīng)。因此，我們分析了分類為激活免疫和耗竭免疫的免疫亞型，據(jù)報(bào)道，它們?cè)诎┌Y進(jìn)展中起著不同的作用，并與患者的臨床結(jié)果相關(guān)。與其他兩種分子亞型相比，預(yù)測(cè)每個(gè)腫瘤中的免疫類型顯示，存活率最差的亞型3表現(xiàn)出耗竭免疫亞型的比例最高，而激活免疫亞型的比例最低。然而，與亞型1相比，亞型1和亞型2的激活免疫亞型比例相似，而存活率良好的亞型2的耗竭免疫亞型比例只有亞型1的一半（圖3D）。此外，我們根據(jù)PBRM1突變?cè)u(píng)估了免疫亞型，并確定與未發(fā)生突變的患者相比，PBRM1突變的患者表現(xiàn)出更高的激活免疫亞型和較低的耗竭免疫亞型（圖3D）。此外，根據(jù)免疫亞型評(píng)估PFS，包括激活免疫、耗竭免疫和非免疫亞型。我們觀察到，免疫激活亞型顯示出更好的PFS（圖3E）。這些結(jié)果表明，每個(gè)分子亞型具有不同的免疫亞型，這可能會(huì)影響與ICIs反應(yīng)性相關(guān)的腫瘤微環(huán)境。此外，ccRCC中激活免疫亞型的過(guò)度免疫可能表明ICIs治療后誘導(dǎo)了攻擊性表型和不良預(yù)后。
4. GATM表達(dá)與PBRM1突變相關(guān)，作為ICIs治療的ccRCC患者治療反應(yīng)的新生物標(biāo)志物
接下來(lái)，確定與亞型2相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，該亞型具有較高比例的PBRM1突變，并顯示出最佳的生存結(jié)果。分析了細(xì)胞系數(shù)據(jù)（GSE102806），包括與PBRM1 LOF相關(guān)的786-O和A-704細(xì)胞系。首先，通過(guò)比較治療樣本和對(duì)照樣本，得到了六個(gè)差異基因集。使用DEGs（包括DEG1、DEG2和DEG3）并通過(guò)執(zhí)行ssGSEA在每個(gè)亞型中確定了不同的表達(dá)模式（圖4A）。值得注意的是，與亞型1和3相比，亞型2的上調(diào)DEG表達(dá)顯著增加，而下調(diào)DEG表達(dá)顯著降低。同樣，攜帶PBRM1突變的腫瘤表現(xiàn)出上調(diào)的DEGs的更高表達(dá)（圖4B）。通過(guò)overlap五個(gè)差異基因集，鑒定出可能與PBRM1突變有關(guān)的四個(gè)基因AMACR、SLC6A3、GATM和USH1C上調(diào)（圖4C）。其中，主要關(guān)注GATM和USH1C，在攜帶PBRM1突變的腫瘤中顯著差異表達(dá)。然后評(píng)估了這兩個(gè)基因的臨床相關(guān)性，在TCGA-KIRC數(shù)據(jù)和合并隊(duì)列數(shù)據(jù)中，GATM的高表達(dá)與改善的總體生存率（OS）相關(guān)（圖4D）。在TCGA-KIRC數(shù)據(jù)中，USH1C的高表達(dá)與OS的臨床結(jié)果相關(guān)（圖4D），而在合并數(shù)據(jù)中，沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4D）。因此，在以下分析中，GATM被列為潛在驅(qū)動(dòng)因素。
5. 免疫組織化學(xué)檢測(cè)GATM蛋白水平與良好的生存率相關(guān)
接下來(lái)，為了驗(yàn)證GATM的預(yù)后作用，通過(guò)IHC染色對(duì)51例轉(zhuǎn)移性ccRCC患者的GATM蛋白表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，并根據(jù)GATM表達(dá)狀態(tài)將其分為兩組（分為GATM陽(yáng)性和GATM陰性）（圖5A）。然后，研究了GATM蛋白水平與生存結(jié)果的關(guān)系。值得注意的是，與GATM陰性組相比，在ICIs治療后，GATM陽(yáng)性組的PFS和OS顯著改善（圖5B）。而后，進(jìn)一步分析了基于PBRM1突變狀態(tài)和分子亞型的GATM蛋白水平，發(fā)現(xiàn)PBRM1突變患者的GATM陽(yáng)性樣本比例高于未發(fā)生PBRM1突變的患者（圖5C）。此外，還觀察到，亞型2的GATM陽(yáng)性病例比例最高，而具有侵襲性表型和較差存活率的亞型3的GATM陽(yáng)性樣本比例最低（圖5C）。這些結(jié)果表明，GATM蛋白水平與PBRM1突變狀態(tài)和侵襲性較低的表型相關(guān)，并顯示出潛在的臨床實(shí)用性，可作為ICIs治療轉(zhuǎn)移性ccRCC的預(yù)后標(biāo)志物。
6. 在應(yīng)激條件下，PBRM1缺失和GATM上調(diào)會(huì)抑制細(xì)胞增殖
檢測(cè)了ccRCC細(xì)胞系中PBRM1的缺失是否調(diào)節(jié)GATM的表達(dá)。Caki-1和786-O細(xì)胞中的PBRM1敲除顯示GATM或USH1C表達(dá)增加（圖6A）。還使用0.5μM放線菌素D（轉(zhuǎn)錄抑制劑）檢測(cè)了PBRM1在轉(zhuǎn)錄水平上是否調(diào)節(jié)GATM的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，與對(duì)照細(xì)胞相比，在用放線菌素D處理的786-O細(xì)胞中，PBRM1敲除后GATM轉(zhuǎn)錄物水平持續(xù)增加（圖6B）。結(jié)果表明，PBRM1基因敲除后，GATM的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上增加。隨后，將轉(zhuǎn)染siScr、siPBRM1或siGATM的786-O細(xì)胞進(jìn)行體外劃痕試驗(yàn)，并與高濃度過(guò)氧化氫（H2O2）孵育12小時(shí)。與對(duì)照細(xì)胞相比，暴露于H2O2中的PBRM1敲除786-O細(xì)胞幾乎沒(méi)有遷移。PBRM1基因敲除和GATM基因敲除的786-O細(xì)胞增強(qiáng)了細(xì)胞遷移，GATM基因敲除的786-O細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性與對(duì)照細(xì)胞中的相似（圖6C）。這些數(shù)據(jù)表明，PBRM1缺失誘導(dǎo)的GATM上調(diào)導(dǎo)致遷移能力喪失。在含有高濃度過(guò)氧化氫或低葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PBRM1缺失的細(xì)胞失去了形成菌落的能力，通過(guò)沉默GATM恢復(fù)了這種能力（圖6D）。更重要的是，研究了GATM表達(dá)和PBRM1突變與臨床預(yù)后的關(guān)系；根據(jù)PBRM1突變和GATM表達(dá)狀態(tài)，將合并數(shù)據(jù)（n=177）和TCGA-KIRC隊(duì)列分為四組：（PBRM1_MUT+高_(dá)GATM、PBRM1_MUT+低_GATM、PBRM1_WT+高_(dá)GATM和PBRM1_WT+低_GATM）。正如預(yù)期的那樣，具有PBRM1突變和GATM高表達(dá)的患者都具有最佳的OS（圖6E）。這些回顧性分析結(jié)果共同表明，PBRM1突變狀態(tài)和GATM表達(dá)被認(rèn)為是ccRCC患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。
四、總結(jié)
文章一開始從PBRM1相關(guān)分子亞型出發(fā)，逐步篩選出與PBRM1相關(guān)因子GATM，并且進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在每一個(gè)層面都進(jìn)行了詳盡分析，所涉及實(shí)驗(yàn)方法和分析方法也相當(dāng)豐富，文章故事邏輯清晰合理，并且該研究有收集新的樣本隊(duì)列，所以可以到6+。
