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實體瘤中淋巴細胞的有限滲透和殺瘤功能的耗盡仍然是癌癥免疫治療的一個巨大障礙。今天小編給大家?guī)硪黄}為“Macrophage Membrane-Coated Nano-Gemcitabine Promotes Lymphocyte Infiltration and Synergizes AntiPD-L1 to Restore the Tumoricidal Function”（IF: 18.027）的文章。本文作者設計了一種巨噬細胞膜包被的納米吉西他濱系統(tǒng)(MNGs)來促進淋巴細胞的滲透，然后協(xié)同抗PD-L1來重新激活耗竭的淋巴細胞。
PD-L1或PD-1檢查點已被證明在各種實體和血液腫瘤類型中具有顯著的治療效果。但絕大多數(shù)患者無法從這種治療方案中受益。ICIs的治療結果在很大程度上取決于腫瘤中預先存在的淋巴細胞識別和殺傷癌細胞。然而，對于非炎癥性腫瘤，會出現(xiàn)免疫沙漠，極大地限制了ICIs的反應。因此，如何促進淋巴細胞的滲入，增強抗腫瘤免疫能力，成為腫瘤免疫治療的關鍵問題。
越來越多的數(shù)據表明，一些治療藥物可以破壞腫瘤間質屏障或使混亂的腫瘤血管正常化、誘導癌細胞的免疫原性細胞死亡和趨化因子的升高。還可以消除各種免疫抑制細胞，下調多種促腫瘤細胞因子，使抑制性腫瘤微環(huán)境重新編程為抗腫瘤功能，很大程度上ICI介導的免疫治療。然而，由于腫瘤間質致密性，這些藥物在腫瘤內的傳遞和給藥的嚴重挑戰(zhàn)。
因此作者設計了一中仿生遞藥系統(tǒng)MNGs能有效促進腫瘤內滲透，增強腫瘤對癌細胞的親和性，激活反應性藥物釋放，發(fā)揮免疫調節(jié)作用，從而協(xié)同抗PD-L1，使耗竭狀態(tài)的浸潤性淋巴細胞恢復殺瘤功能，產生顯著的治療效益。
吉西他濱(Gem)是一種有效的化學免疫調節(jié)分子，可以消除多種免疫抑制細胞，增強免疫識別，促進NK細胞的激活。將其設計成組織蛋白酶B敏感的疏水脂肪前藥(C14-Gem)。MNGs是通過將巨噬細胞膜（MM）偽裝到由pH敏感的聚合物PEG-PDPA和C14-Gem組成的納米吉西他濱系統(tǒng)（NG）上而開發(fā)的。與NGs不同的是，MNG呈現(xiàn)出典型的core?shell球形納米結構，MM的蛋白質組成大部分保留在MNG中(圖1a,b)。同時，MM中CD11b、CCR2和ATPase的典型信號在MNG中很容易觀察到(圖1c)。MNG可以保持巨噬細胞有趣的趨瘤特性。高效液相色譜法（HPLC）測定了C14-Gem在NGs和MNG中的封裝效率(EE)，表明它們在模擬生理液體中的良好穩(wěn)定性(圖1d)。HPLC分析表明C14-Gem在細胞內酸性環(huán)境中具有響應性的釋放行為(圖1e)。NGs和MNGs在pH 5.5的介質中納米結構崩潰(圖1f)。
此外，當C14-Gem在pH為5.5的介質中與組織蛋白酶B孵育時，C14-Gem能有效地降解為活性Gem。證實了組織蛋白酶B在C14-Gem降解過程中的重要作用。因此，MNGs可以在細胞內酸性環(huán)境中迅速釋放C14-Gem，然后被組織蛋白酶B以編程方式降解為活性Gem，發(fā)揮藥理活性。
在4T1乳腺癌模型中檢測MNGs和NGs在腫瘤中的蓄積。用DiIC18(DiI)熒光探針標記NGs和MNGs。NGs和MNGs的DiI在不同時間點的腫瘤部位均有明顯的紅色熒光信號。體外成像證實，這兩種納米載體的優(yōu)勢腫瘤聚集(圖2a，b)。然后，用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)成像測定腫瘤內的滲透曲線。在腫瘤組織的橫斷面上，MNGs的熒光信號強度遠高于NGs(圖2c，e)。然后，CLSM來評估了MNGs從腫瘤血管外溢到周圍腫瘤實質中的情況，NGs主要局限于腫瘤血管周圍(圖2d)。MNG的紅色熒光信號在腫瘤血管周圍明顯可見，并在距離腫瘤血管管腔200μm處仍保持高強度。而神經生長因子主要位于腫瘤血管周圍40μm以內，且隨著腫瘤血管距離的增加，其熒光強度明顯降低(圖2f)。這些數(shù)據證實了MNGs在腫瘤內滲透和腫瘤血管外滲方面的顯著效果。
之后，作者評估了在穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(4T1-GFP)的4T1癌細胞誘導的腫瘤中，MNG對癌細胞部分的可及性（圖2g，h）。巨噬細胞通過NGs的腫瘤內轉運和癌細胞可及性的增強可能歸因于巨噬細胞模仿腫瘤的親和性。
關于Gem的免疫調節(jié)作用，作者評估了它們在4T1腫瘤模型中重新編程STM的效果。首先測量了MNG在消除這些免疫抑制細胞方面的效果(圖3a)。與陰性對照相比，MDSCs、Tregs和M2樣TAM的頻率分別降低了67.96%、32.18%和73.11%(圖3b?e，)，表明MNG對清除腫瘤中多種免疫抑制細胞具有顯著效果。隨后，檢測了MNG對TGF-β1和IL10產生的影響(圖3f，g)。MNG能有效地清除抑制性免疫細胞，降低前列腺癌組織中TGF-β1和IL10的水平，具有顯著的緩解STM的作用。
通過免疫熒光方法研究了MNGs對腫瘤中PD-L1表達的影響。在MNG處理組，PD-L1的紅色熒光信號在4T1-GFP癌細胞及其鄰近區(qū)域廣泛檢測到，其強度遠高于其他處理組(圖3h)。MNG治療后PD-L1表達的增加可以促進抗PD-L1介導的抗腫瘤免疫治療。
淋巴細胞在腫瘤中的滲透和向癌細胞巢的轉運是腫瘤免疫治療的基本前提。CD8+T細胞和NK細胞是實現(xiàn)腫瘤殺傷功能的主要效應細胞。用流式細胞儀檢測各組4T1腫瘤患者外周血中CD3+CD8+T細胞和NK細胞(圖4a-c)。此外，腫瘤細胞分泌TNF-α和IFN-γ分別是相應的NG治療組的1.6倍和1.31倍(圖4d)。這些數(shù)據證實了MNG治療能提高腫瘤中CD3+CD8+T細胞和NK細胞的頻率。
在激光共聚焦顯微鏡下用免疫熒光染色方法檢測CD8+T細胞在癌巢中的浸潤情況(圖4e)。在MNG處理組，CD8+T細胞廣泛分布在癌細胞區(qū)附近和高熒光強度的巢穴內。同樣，檢測了NK細胞在腫瘤中的滲透情況(圖4f)。結果表明，MNG可顯著促進CD8+T細胞和NK細胞向腫瘤細胞部分的轉運。
然后，探討了MNG促進腫瘤淋巴細胞浸潤的可能機制。腫瘤細胞的浸潤主要與腫瘤血管的供應、腫瘤間質的阻礙和趨化因子的分泌有關。在MNG處理組，CCL5、CXCL9和CXCL10的表達分別是陰性對照組的4.35、2.82和5.31倍，是NG處理組的1.92、2.05和2.44倍（圖4g）。因此，MNG誘導的淋巴細胞趨化因子的上調可能是促進腫瘤中淋巴細胞浸潤的主要因素。
之后，評估了MNGs及其聯(lián)合抗PD-L1在三種小鼠腫瘤模型（4T1乳腺癌模型、PANC02胰腺癌模型和CT-26結腸癌模型）中的抗腫瘤效果。其中4T1和PANC02為低免疫原性腫瘤，淋巴細胞浸潤少，PD-L1表達低，而CT-26腫瘤為高免疫原性腫瘤。在這三種模型中，MNGs的抗腫瘤作用并沒有顯著增強。MNG治療組腫瘤逐漸發(fā)展，達到極限死亡體積，與PBS對照組相比，生存期適度延長。當它們與抗PD-L1聯(lián)合使用時，在這三種腫瘤模型中，MNGs+抗PD-L1組的腫瘤體積明顯小于MNG或抗PD-L1單獨治療組。與MNG或抗PD-L1單一治療相比，無論是在低免疫原性的4T1和PANC02腫瘤模型中，還是在高免疫原性的CT-26模型中，MNGs+抗PD-L1治療都顯著延緩了腫瘤的進展，并明顯延長了總生存期(圖5)。這些數(shù)據有效地證實了MNGs在協(xié)同抗PD-L1介導的癌癥免疫治療方面的顯著效果。
盡管MNG治療促進了腫瘤中淋巴細胞的浸潤，但其中很大一部分處于衰竭狀態(tài)。與相應的NGs相比，MNG治療的腫瘤中PD-L1檢查點的上調和浸潤性淋巴細胞的耗盡可能是抗腫瘤療效改善有限的主要原因。作者重點研究了MNGs+抗PDL1治療對4T1腫瘤中這些浸潤性淋巴細胞狀態(tài)和功能的影響(圖6)。MNGs+抗PD-L1處理組中PD-1 CD3+CD8+PD-1+T細胞的比例顯著降低，CD3+CD8+granzyme-B+ T細胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T細胞增加(圖6a，b)。同時，測量了它們對4T1腫瘤中浸潤性NK細胞狀態(tài)和功能的影響(圖6E?h)。因此，MNGs與抗PD-L1聯(lián)合應用可有效恢復腫瘤中浸潤性淋巴細胞的殺瘤功能，有利于增強其抗腫瘤活性。
在原位胰腺癌模型和原位結腸癌模型中檢測了MNGs+抗PD-L1聯(lián)合治療的療效。與其他治療方法相比，MNGs+抗PD-L1治療可明顯降低熒光素標記腫瘤的信號(圖7a)。MNGs+抗PD-L1聯(lián)合治療顯著延長了生存時間和生存率(圖7b)。在CT-26誘導的原位結腸癌模型中，MNGs+抗PD-L1治療組的中位生存期為56天，顯著高于其他組。這些數(shù)據證實，在這兩種原位腫瘤模型中，MNGs+抗PD-L1聯(lián)合治療比其他治療方法有更好的治療效果。
綜上所述，作者設計了一種巨噬細胞膜包裹的納米吉西他濱系統(tǒng)（MNG），以促進淋巴細胞的滲透，并協(xié)同抗PD-L1來重振耗盡的淋巴細胞，從而有效地治療癌癥。在4T1腫瘤中，MNGs表現(xiàn)出靈活的滲透性，并緩解了免疫抑制。此外，MNGs增強了腫瘤中淋巴細胞的浸潤，但卻意外地增加了腫瘤中耗盡淋巴細胞的比例，并增加了PD-L1的表達。MNGs聯(lián)合抗PDL1有效地恢復了浸潤性淋巴細胞的殺癌作用，并在幾種腫瘤模型中產生了顯著的治療效果。因此，MNG提供了一種策略來促進淋巴細胞的滲透，并協(xié)同抗PD-L1以恢復其對腫瘤的殺瘤功能，用于癌癥免疫治療。
