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1. 概述
隨著分析生物學(xué)、微流控技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，已使研究惡性腫瘤中數(shù)千甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞分辨率成為可能。腫瘤和相關(guān)免疫細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀(guān)基因組和蛋白質(zhì)組特征的高維、多面表征使腫瘤異質(zhì)性、腫瘤細(xì)胞和它們的微環(huán)境之間的復(fù)雜相互作用以及每個(gè)腫瘤進(jìn)化軌跡的細(xì)節(jié)得以解剖。來(lái)自美國(guó)的研究人員在《Nature Reviews Clinical Oncology》發(fā)表了Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy文章。在該文章中，首先闡明了單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、表觀(guān)基因組和基因組技術(shù)是如何改變我們對(duì)抗癌免疫治療的反應(yīng)性和耐藥性的理解，并探索整合多種模式的分析方法。然后說(shuō)明了單細(xì)胞T細(xì)胞受體(TCR)分析的重要性，并重點(diǎn)調(diào)查了單細(xì)胞空間組學(xué)分析與適用性免疫腫瘤相關(guān)的新興技術(shù)。最后，討論了單細(xì)胞技術(shù)的未來(lái)發(fā)展方向，以及它們?cè)诖龠M(jìn)免疫腫瘤領(lǐng)域的發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。
2. 單細(xì)胞組學(xué)
2.1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組
單細(xì)胞RNA測(cè)序(Single- cell RNA sequencing, scRNA-seq)是指一組技術(shù)，可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行非靶向定量。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組scRNA- seq可識(shí)別新的細(xì)胞類(lèi)型、研究罕見(jiàn)的細(xì)胞群、并定義細(xì)胞狀態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育譜。圖1給出了腫瘤免疫單細(xì)胞分析工作流程。
2.2 腫瘤細(xì)胞和免疫治療反應(yīng)
無(wú)論是在腫瘤之間還是在個(gè)體腫瘤內(nèi)部，癌癥的異質(zhì)性是scRNA-seq分析腫瘤細(xì)胞突出的主要特征。當(dāng)患者的多個(gè)惡性細(xì)胞聚集在一起時(shí)，在膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和卵巢癌等疾病中，單個(gè)細(xì)胞組的轉(zhuǎn)錄譜主要是由患者的自身決定的。這種患者-患者的異質(zhì)性使得用單個(gè)腫瘤細(xì)胞的scRNA-seq分析來(lái)研究患者對(duì)治療的反應(yīng)變得復(fù)雜化。 因此，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞分析應(yīng)用于識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型和與患者之間共享的免疫治療反應(yīng)相關(guān)的狀態(tài)時(shí)更加富有成效。
2.3 免疫和基質(zhì)細(xì)胞及免疫治療反應(yīng)
這一領(lǐng)域的重點(diǎn)是在非惡性組織中創(chuàng)建詳細(xì)的細(xì)胞免疫圖譜，然后將這些圖譜和方法應(yīng)用到腫瘤環(huán)境中。例如，Szabo等通過(guò)分析來(lái)自肺、淋巴結(jié)、骨髓和血液的50000個(gè)靜止的和激活的T細(xì)胞所繪制的人類(lèi)非惡性T細(xì)胞激活參考圖。
在免疫治療的背景下，將基于scRNA-seq分析的免疫腫瘤學(xué)方法(Table1)應(yīng)用于TME中的免疫和基質(zhì)細(xì)胞，能夠闡明轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是免疫治療(如ICIs)的反應(yīng)和抵抗的基礎(chǔ)。同時(shí)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白水平的結(jié)合，可以為新的免疫療法提供新的共表達(dá)靶點(diǎn) 。
2.4 相互作用分析
通過(guò)將配體受體對(duì)在不同細(xì)胞類(lèi)型之間的表達(dá)關(guān)聯(lián)起來(lái)，可以從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷出這些重要細(xì)胞間相互作用的信息。例如:腫瘤相關(guān)的樹(shù)突狀細(xì)胞和外周血T細(xì)胞之間的相互作用。該研究涉及16例初始肝細(xì)胞癌患者，使用scRNA-seq分析腫瘤、鄰近肝臟、肝淋巴結(jié)、血液和腹水中的白細(xì)胞。譜系分析顯示一種新型的LAMP3+ DCs能夠從腫瘤轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。這些LAMP3+ DCs樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)了許多可能的抑制性配體受體對(duì)，并與多個(gè)T細(xì)胞亞群相關(guān)，提示其在促進(jìn)T細(xì)胞凋亡中的作用以及外周血T細(xì)胞的功能障礙。
2.5 scRNA- seq的局限性。
首先，scRNA-seq數(shù)據(jù)本質(zhì)上是嘈雜的，因?yàn)檎婧松锏霓D(zhuǎn)錄并不是以相同的基礎(chǔ)速率進(jìn)行。
其次，僅使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)建立基因型和表現(xiàn)型之間的相關(guān)性仍然具有挑戰(zhàn)性。除了scRNA-seq的一些固有限制之外，與樣本采購(gòu)和處理相關(guān)的具體細(xì)節(jié)也可能混淆結(jié)果。scRNA-seq依賴(lài)于可存活的單細(xì)胞懸液，但通常從外周血或淋巴結(jié)中獲得，很難從實(shí)體腫瘤組織中獲得。分離方法和低溫保存條件的差異也會(huì)引起相當(dāng)大范圍的轉(zhuǎn)錄組變化。為了解決這些問(wèn)題，研究人員開(kāi)始制定規(guī)范組織分離和單細(xì)胞懸浮液制備的方案，其中單核RNA測(cè)序(snRNA-seq) 適用于許多不同的組織類(lèi)型，與冷凍樣本兼容，有時(shí)可以提供比scRNA- seq更少的細(xì)胞覆蓋。
最后，批次效應(yīng)。盡管已有多種方法來(lái)矯正這種批次效應(yīng)，但存在掩蓋真實(shí)生物差異的風(fēng)險(xiǎn)。
3. 蛋白質(zhì)組學(xué)
3.1 大量細(xì)胞計(jì)數(shù)方法
一般在使用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)的非靶向檢測(cè)缺乏與單細(xì)胞分析相關(guān)的足夠的靈敏度,因此，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要依賴(lài)于使用抗體或類(lèi)似的親和試劑(如附著體或適配體)對(duì)目標(biāo)的選擇性檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)是研究人員在單細(xì)胞水平上評(píng)估蛋白表達(dá)的主要手段，但檢測(cè)的抗原表位數(shù)量受到熒光團(tuán)光譜重疊的限制。金屬同位素標(biāo)記抗體的大規(guī)模細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，大大增加了可以同時(shí)分析的標(biāo)記的數(shù)量，從而能夠?qū)渭?xì)胞上表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行高維檢測(cè)。
3.2 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的新興技術(shù)
下一代光譜分析儀的出現(xiàn)有望擴(kuò)展基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)的能力，達(dá)到與大規(guī)模細(xì)胞術(shù)競(jìng)爭(zhēng)的水平。這些系統(tǒng)相對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是能夠利用現(xiàn)有的大量熒光標(biāo)記抗體，因?yàn)樗鼈儾幌窳魇郊?xì)胞術(shù)那樣破壞細(xì)胞，可以為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分類(lèi)和分離細(xì)胞。如：用條形碼寡核苷酸而不是熒光團(tuán)或重金屬離子標(biāo)記抗體，消除了對(duì)同時(shí)可分辨目標(biāo)數(shù)量的限制。
其他抗體靶向的單細(xì)胞策略包括基于組織的細(xì)胞術(shù)(Box 1)，這增加了空間分辨率的提高水平，以及微流控細(xì)胞術(shù)，其中細(xì)胞被固定在微流控芯片上，而不是在流式中分析。芯片細(xì)胞術(shù)可以反復(fù)染色;在相同的細(xì)胞樣本上，可以檢測(cè)和量化標(biāo)記的分?jǐn)?shù)。單細(xì)胞條形碼芯片技術(shù)，則用于檢測(cè)單細(xì)胞所分泌的蛋白質(zhì)。
3.3 基因組學(xué)方法
全基因組和全外顯子組測(cè)序的許多方法還沒(méi)有過(guò)渡到高維分析，這在很大程度上是因?yàn)檫@種測(cè)序的高成本妨礙了將每個(gè)患者的細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大到相當(dāng)大的數(shù)量。一種將微流體與融合液滴相結(jié)合的Tapestri系統(tǒng)成為了一種更有效的方法。首先使用大量腫瘤DNA樣本的深度測(cè)序來(lái)識(shí)別sSNVs，然后使用單細(xì)胞DNA定向測(cè)序來(lái)檢測(cè)導(dǎo)致癌變的體細(xì)胞突變或結(jié)構(gòu)的突變。
3.4 表觀(guān)基因組分析方法
結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)的靶向開(kāi)放染色質(zhì)測(cè)序(ATAC-seq)、免疫共沉淀測(cè)序(ChIP-seq)、亞硫酸氫鹽DNA甲基化測(cè)序以及染色體構(gòu)象捕獲(如3C和Hi-C) 都已適用于單細(xì)胞分析。在多種方法中，單細(xì)胞(sc)ATAC-seq是目前唯一具有足夠高吞吐量的方法，因此被廣泛采用 。單細(xì)胞表觀(guān)基因組學(xué)是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，特別是當(dāng)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合時(shí)，很可能是腫瘤學(xué)單細(xì)胞分析的下一個(gè)主要進(jìn)展之一。用于單細(xì)胞DNA甲基化分析的亞硫酸氫鹽測(cè)序，以及單細(xì)胞ChIP-seq的CUT&Tag等，這些方法將進(jìn)一步擴(kuò)展在單個(gè)細(xì)胞水平上分析表觀(guān)遺傳變化的能力。
3.5 RNA、DNA和蛋白質(zhì)。
將單細(xì)胞蛋白質(zhì)檢測(cè)納入scRNA-seq協(xié)議的技術(shù)(如CITE-seq和REAP-seq)使用抗體與條形碼寡核苷酸結(jié)合，使通過(guò)scRNA-seq的cDNA測(cè)序步驟能夠檢測(cè)基于蛋白質(zhì)的標(biāo)記物。從而使蛋白質(zhì)檢測(cè)沒(méi)有光譜重疊或可分解金屬離子數(shù)量的限制。在非靶向轉(zhuǎn)錄組分析中加入基于抗體的檢測(cè)數(shù)十到數(shù)百種蛋白質(zhì)的能力，以及通過(guò)在傳統(tǒng)免疫學(xué)框架內(nèi)定義轉(zhuǎn)錄組，可以減少因轉(zhuǎn)錄缺失而引起的歧義，從而大大提高評(píng)估TME的能力。使用寡核苷酸標(biāo)記的抗體也已被納入Tapestri的工作流程，用于單細(xì)胞DNA測(cè)序，提供了連接基因型和表型的直接方法。
3.6 譜系追蹤
scATAC-seq能夠同時(shí)測(cè)量細(xì)胞系(通過(guò)線(xiàn)粒體基因組)和細(xì)胞命運(yùn)(通過(guò)核表觀(guān)基因組)，線(xiàn)粒體突變也可以在scRNA-seq數(shù)據(jù)中檢測(cè)到，但沒(méi)有scATAC-seq數(shù)據(jù)穩(wěn)定，因?yàn)榫€(xiàn)粒體基因組的覆蓋率較低且不一致。這種譜系追蹤分析在未來(lái)可以應(yīng)用于更好地了解哪些腫瘤細(xì)胞克隆在對(duì)特定治療的反應(yīng)中擴(kuò)張或收縮，從而可以知道哪些克隆可能與治療抗性有關(guān)。
3.7 單細(xì)胞T細(xì)胞受體分析
T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要部分，負(fù)責(zé)抗腫瘤免疫，因此是FDA批準(zhǔn)的大多數(shù)癌癥免疫療法(如ICIs、過(guò)繼細(xì)胞療法、肽或RNA疫苗、基于細(xì)胞因子的療法和溶瘤病毒療法)的主要重點(diǎn)。
TCR是一種由兩條鏈組成的異源二聚體，基因重組可產(chǎn)生多種TCR序列。大多數(shù)T細(xì)胞(95%)攜帶單個(gè)TCR的α和β亞基，它們共同識(shí)別同源肽MHC抗原?；谶@種TCR-肽-MHC的相互作用，免疫原性腫瘤中出現(xiàn)的TILs具有消除腫瘤的潛力。單細(xì)胞方法還可以識(shí)別成對(duì)的α和β TCR亞基，這是確定浸潤(rùn)性T細(xì)胞特異性的關(guān)鍵一步。這些信息可能不僅有助于解釋對(duì)當(dāng)前免疫療法的耐藥性(如腫瘤特異性的缺乏)，而且還有助于發(fā)現(xiàn)高活性的抗腫瘤TCR，這些TCR可用于新的工程TCR細(xì)胞療法。
整合scRNA-seq和scTCR-seq提供了一種特別有效的方法來(lái)分析免疫治療過(guò)程中免疫細(xì)胞的表型和功能特征。通過(guò)對(duì)T細(xì)胞的單細(xì)胞表型分析(如通過(guò)scRNA-seq)與識(shí)別它們各自的TCR克隆型相補(bǔ)充，這些綜合方法為免疫細(xì)胞分析增加了T細(xì)胞抗原特異性的關(guān)鍵信息，從而能夠更好地解剖抗原特異性T細(xì)胞在免疫治療反應(yīng)中的作用。此外，在免疫治療過(guò)程中縱向收集的血液樣本中，對(duì)擴(kuò)大的TCR克隆進(jìn)行非侵入性識(shí)別，可能會(huì)為腫瘤中臨床相關(guān)TCR的識(shí)別和功能提供見(jiàn)解。
4. 高維空間分析技術(shù)
腫瘤免疫微環(huán)境的空間變異性越來(lái)越被認(rèn)為是導(dǎo)致大多數(shù)癌癥類(lèi)型的異質(zhì)性和可變治療反應(yīng)的原因。免疫組化、免疫熒光蛋白選擇性免疫染色、核酸原位雜交已經(jīng)成為癌癥診斷、分類(lèi)、治療選擇和預(yù)后不可缺少的空間方法（詳見(jiàn)BOX1）。
5. 未來(lái)的方向
盡管免疫療法已經(jīng)改變了許多晚期惡性腫瘤的治療方法，但大多數(shù)患者要么對(duì)相關(guān)藥物無(wú)反應(yīng)，要么最終產(chǎn)生耐藥性。數(shù)以千計(jì)的臨床試驗(yàn)聯(lián)合免疫治療方法使得免疫和非免疫治療藥物都已經(jīng)完成或在進(jìn)行中。但設(shè)計(jì)合理的免疫療法——包括克服原發(fā)性或獲得性、耐藥性的組合將需要對(duì)每種癌癥類(lèi)型的腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)行綜合表征，并詳細(xì)了解在治療的背景下有效的抗腫瘤免疫的決定因素。單細(xì)胞技術(shù)能夠?qū)ME進(jìn)行全面的分析，因此特別適合于研究腫瘤和免疫細(xì)胞的異質(zhì)性，以及這種腫瘤生物學(xué)上的差異如何導(dǎo)致治療耐藥性。
為了有效地利用單細(xì)胞技術(shù)來(lái)提高我們對(duì)免疫治療反應(yīng)和耐藥性機(jī)制的理解，并幫助開(kāi)發(fā)新的治療方法，臨床試驗(yàn)將必須以一種可行的方式納入單細(xì)胞方法。利用數(shù)據(jù)豐富的單細(xì)胞信息和生物信息學(xué)算法，將大量RNA-seq數(shù)據(jù)映射到由scRNA- seq和相關(guān)技術(shù)定義的細(xì)胞類(lèi)型上。高維單細(xì)胞技術(shù)可以更容易地應(yīng)用于臨床，包括那些擴(kuò)展傳統(tǒng)方法信息內(nèi)容的技術(shù)，如免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)。對(duì)于來(lái)自血液惡性腫瘤和其他容易分散到單個(gè)細(xì)胞的樣本，結(jié)合熒光標(biāo)記物的大規(guī)模細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)開(kāi)始成功。
6. 結(jié)論
單細(xì)胞RNA測(cè)序和相關(guān)模式正日益成為表征免疫治療反應(yīng)和耐藥性的重要研究工具。此外，需要單細(xì)胞TCR分析來(lái)確定T細(xì)胞抗原的特異性，并提供適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在腫瘤形成、生長(zhǎng)和治療中的作用的關(guān)鍵信息。單細(xì)胞分析的下一個(gè)前沿是將高維含量與精確的組織定位相結(jié)合。高維單細(xì)胞分析的臨床應(yīng)用包括識(shí)別免疫治療反應(yīng)的高維生物標(biāo)記物，能夠細(xì)化批量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，并理解TME中復(fù)雜的細(xì)胞空間相互作用，從而驅(qū)動(dòng)免疫治療的反應(yīng)。考慮到可能的免疫治療基質(zhì)的不斷增加，以及腫瘤異質(zhì)性和治療性耐藥性的個(gè)性化特性，癌癥治療的未來(lái)是聯(lián)合治療。因此，多維的生物標(biāo)記將是為每個(gè)癌癥患者做出最佳治療選擇的關(guān)鍵，而高維單細(xì)胞技術(shù)在免疫腫瘤學(xué)中將提供所需數(shù)據(jù)的分辨率和豐富性。
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