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最新：人類Treg未被識別的效應(yīng)器亞群和雙路徑分化結(jié)構(gòu)

文獻解讀 SCI ·2022年3月8日 12:16

最新：人類T_reg未被識別的效應(yīng)器亞群和雙路徑分化結(jié)構(gòu)

今天給大家介紹一篇單細胞測序的文章，人FOXP3⁺調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞是免疫耐受的核心細胞。然而，它們的異質(zhì)性和差異性仍不完全清楚。在這里，作者使用單細胞RNA和T細胞受體測序來解析接受干細胞移植的健康人和患有或不患有急性移植物抗宿主病(AGVHD)的患者的Treg細胞。軌跡分析將Treg亞群組裝成兩條分化路徑(I/II)，分別以FOXP3^hi和MKI67 ^hi亞群結(jié)束，具有不同的表型和功能程序。這些發(fā)現(xiàn)擴大了對樹突狀細胞異質(zhì)性和分化的理解，并為剖析健康和疾病中樹突狀細胞的復(fù)雜性提供了單細胞圖譜。文章發(fā)表在期刊: Nature Communications在最近一年的影響因子: 14.919比去年增加了 2.798。中科院大類: 綜合性期刊 1區(qū)。中科院小類: 1區(qū) 綜合性期刊。

背景知識：

GVHD：急性移植物抗宿主病

PB：外周血

BM：骨髓血

結(jié)果解讀：

ScRNA-seq可在人FOXP3⁺T_reg細胞中分辨出不同的亞群

作者首先對健康供者和伴有或不伴有aGVHD的allo-HSCT患者的T_reg細胞進行了scRNA-seq檢測。用10倍基因組學(xué)平臺對健康供者和伴有或不伴有aGVHD的異基因造血干細胞移植患者外周血和骨髓中分離出的CD4⁺CD25⁺CD127^?T_reg和CD4⁺CD25^?常規(guī)T (T_con)細胞進行單細胞RNA-序列分析（Fig.1a）。最后，定義了健康供者外周血和骨髓Tregcell中的9個簇(Fig.1b)。根據(jù)幼稚和效應(yīng)性Treg細胞的標(biāo)記物，包括CCR7、HLA-DR和FOXP3，以及PB(P0，P3，P5)和BM(B0，B1，B4)中每個簇0，3，5和0，1，4的前10個簽名基因和簽名轉(zhuǎn)錄因子，與CCR7^hiTCF7^hiHLA-DR^lowFOXP3^lowprofile完美匹配原始狀態(tài)（Fig.1c, d）。此外，基于PAGA（the partition-based graph abstraction）映射顯示了幼稚（原始）群集之間以及激活/效應(yīng)器群集之間的高度連通性(Fig.1e)。P8和B8被命名為MKI67^hi效應(yīng)器亞群。盡管FOXP3^hi和MKI67^hiT_reg細胞亞群在PB和BM之間高度保守，但它們也顯示出組織特異性的基因表達差異(Fig.1f)。為了比較不同簇之間的功能/穩(wěn)態(tài)特征，進行了基因集變異分析(GSVA) (Fig.1g)。

Fig. 1 ScRNA-seq and TCR-seq reveals distinctive subsets among human FOXP3⁺T_regcells.

ScTCR-seq揭示了Tregcell亞群之間的擴增和轉(zhuǎn)變

TCR由單個T_reg細胞克隆唯一表達。為了追蹤單個Treg細胞的擴增歷史，在11,830個分選的FOXP3+Tregcell和1,519個分選的T細胞中同時進行了scRNA-seq和配對scTCR-seq。原始、FOXP3^hi或MKI67^hi亞群中沒有或極少數(shù)細胞含有克隆擴增的TCR (Fig.1h)。

T_reg細胞亞群的體外測定

為了在體外評價Treg亞群的功能和動態(tài)平衡特性，作者確定了不同簇的細胞表面標(biāo)記候選(Fig.2a)。并且通過流式細胞儀分選，從外周血中分離出簇群(Fig.2b)。FOXP3^hi和MKI67^hi亞群中的細胞最大，分別顯示FOXP3和Ki67蛋白的最高表達(Fig.2c, d)FOXP3^hi和MKI67^hi亞群對應(yīng)答T(Tresp)細胞增殖的抑制作用最強，其次是LIMS1^hi和HLA-DR^hi亞群，然后是其他激活/效應(yīng)亞群(Fig.2e)。在培養(yǎng)過程中，激活/效應(yīng)亞群的凋亡率比大多數(shù)幼稚亞群略高。另外，培養(yǎng)的LIMS1^hi亞群細胞中有很大一部分丟失了FOXP3蛋白。LIMS1^hi亞群很少表達Helios(由IKZF2編碼)，Helios被認為是胸腺來源的Treg細胞的潛在標(biāo)志。

Fig. 2 In vitro assay of T_regcell subsets.

偽時分析揭示的兩條效應(yīng)器分化途徑

為了描繪子集之間的層次和發(fā)展關(guān)系，作者使用偽時間分析。這一發(fā)現(xiàn)意外地揭示了PB和BM的兩條效應(yīng)器分化途徑(稱為PAYH I和PAYH II) (Fig.3a)。確定了PAYH I(如PTPRC、DDX17、MALAT1和PDE3B)和PAYH II(如HLA-DR、LGALS1/3和CD74 (Fig.3b)。GO分析表明，在PB和BM中，分支前富集基因與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的翻譯和蛋白質(zhì)靶向有關(guān)，PAYH I富集基因與細胞間粘附和細胞聚集有關(guān)，PAYH II富集基因在免疫系統(tǒng)過程中起作用(Fig.3c)。GSVA結(jié)果顯示，與PAYH I細胞相比，PAYH II細胞表達更高的TCR、激活、抑制、遷移、凋亡、S和G2/M基因集(Fig.3d)。 PATH I細胞優(yōu)先表達FAO基因組，PATH II細胞主要表達糖酵解和TCA基因組(Fig.3d)。PAYH II末端高表達可溶性抑制基因LGALS1、TGFB1、GZMA、IL10、IL12A和增殖基因TOP2A、PCNA、HMGB2，S+G2/M細胞比例稍高(Fig.3e)。TCR分析表明，大多數(shù)擴增的TCR克隆型都在Path II細胞中(Fig.3f)。共享的TCR主要在Pre-branch和Path II之間以及Path徑II和Path I之間觀察到，這表明從Pre-branc到Path II的顯性分化以及Path II和Path I細胞之間的過渡(Fig.3g) 而Path II MKI67^hi組子集沒有過渡到Path I單元(Fig.3h)這提示MKI67^hi亞群可能是一個特殊發(fā)育的亞群。

**Fig. 3 Pseudotime analysis and scTCR analysis defines two differentiation paths.**

兩種分化途徑的體外測定

識別不同PAYH的表面標(biāo)記以驗證兩條PAYH的屬性。途徑I細胞表達較多的CD25和CTLA4蛋白，而途徑II細胞表達更多的IL 10和轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白(Fig.4a, b)。然而，GZMA、GZMB和LAP蛋白的表達總體上是非常低的，并且在PAYH II和PAYH I細胞中僅略有不同(Fig.4b, c)。在體外，PATH I細胞比PATH II細胞和分支前細胞具有更強的抑制能力但更弱的增殖能力(Fig.4d, e)。因此，單細胞轉(zhuǎn)錄與功能分析相結(jié)合，在T_reg細胞中定義了兩條效應(yīng)器分化途徑。

Fig. 4 In vitro assay of T_regcell paths.

富集于兩條分化途徑的轉(zhuǎn)錄因子

為了了解分叉分化的轉(zhuǎn)錄因子基礎(chǔ)，作者鑒定了PB T_regcell中每條途徑的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子。TCF7、FOXP3和SUB1分別是來自PB的分支前細胞、PAYH I細胞和PAYH II細胞中最重要的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子（Fig.5a）。單細胞相關(guān)分析表明，F(xiàn)OXP3在單個細胞中優(yōu)先與途徑I相關(guān)的抑制基因IL2RA、CTLA4和FGL2共表達，而SUB1經(jīng)常與途徑II相關(guān)的抑制基因EBI3、IL12A、IL10、TGFB1、GZMA、GZMB和LGALS1共表達，與增殖基因MKI67、MCM6、TOP2A、PCNA和CYCLINs共表達(Fig.5b)。重組慢病毒感染T_con和 T_reg細胞后Foxp3和SUB1成功過表達(Fig.5c, d)。Foxp3過表達使IL2RA、CTLA4、FGL2、PRF1和IL12AmRNA水平升高。SUB1過表達增加Tregcell中IL10、HMGB2和MKI67mRNA水平(Fig.5e) SUB1過表達增加IL10蛋白水平，輕度增加Ki67蛋白Tregcell (Fig.5f–j)。

**Fig. 5 Transcription factors enriched in Tregcell differentiation paths.**

伴或不伴aGVHD的allo-HSCT患者的T細胞亞群

異基因造血干細胞移植后T_regcell大量再生，但如果并發(fā)aGVHD，其功能和數(shù)量會受到損害。結(jié)果表明，F(xiàn)oxP3亞群(非aGVHD P4、aGVHD P6、非aGVHD B6、aGVHD B4)和MKI67亞群(非aGVHD P5、aGVHD P7、非aGVHD) (Fig.6a–c)。這些結(jié)果表明FOXP3^hi和MKI67^hi組亞群在異基因造血干細胞移植后仍保持其特性，但其他效應(yīng)樹突狀細胞發(fā)生了顯著的變化。T_reg亞群的GSVA分析表明，非aGVHD患者的效應(yīng)T_reg亞群比健康獻血者的抑制相關(guān)基因表達略高(Fig.6d)。FOXP3^hi或MKI67^hi亞群在非aGVHD和aGVHD條件下幾乎沒有差異表達的基因(Fig.6e)。

Fig. 6 T_regsubsets in allo-HSCT patients with or without aGVHD.

伴或不伴aGVHD的allo-HSCT患者的T_regpath

來自allo-HSCT患者的Tregcell保留了兩條分化途徑，大部分在PATH I末端有FOXP3^hi亞群(非aGVHD BM除外)，在PATH II末端有MKI67^hi亞群(Fig.7a)。GSVA顯示，在異基因造血干細胞移植患者中，PAYH II仍然比PAYH I具有更高的TCR信號、抑制、遷移、細胞周期、凋亡、糖酵解和TCA，這與在健康供者中的觀察結(jié)果相似(Fig.7b)。對單個基因的檢測顯示，與非aGVHD患者相比，aGVHD患者在分支前表達較低水平的CCR7和CXCR6，在PATH I中表達較低水平的CTLA4、PRF1、GZMA、TGFB1、CCR3、CCR5、CCR9、CCR10、CXCR3和CXCR6，較低水平的CTLA4、ENTPD1、GZMA、CCR1/2/3/5/7/9、CZMA和CCR1/2/3/5/7/9、CZMA(Fig.7c)。這些結(jié)果提示，aGVHD樹突狀細胞在抑制和遷移過程中存在PAYH特異性缺陷。

Fig. 7 T_regPaths in allo-HSCT patients with or without aGVHD.

全文小結(jié)：

綜合的研究揭示了人類T_reg以前未被識別的效應(yīng)器亞群和雙路徑分化結(jié)構(gòu)。這些方面在PB和BM之間以及穩(wěn)態(tài)條件和免疫紊亂之間是保守的。闡明了不同亞群和途徑中與功能、遷移、代謝、激活、增殖、TCR信號和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的特征。作者還認為轉(zhuǎn)錄因子FOXP3和SUB1可能參與促進雙途徑的某些特征。這些發(fā)現(xiàn)豐富了人類T_reg細胞異質(zhì)性、功能和分化的知識，并提供了一個單細胞分辨率圖譜，這將有助于更好地理解T_reg細胞和T_reg細胞相關(guān)疾病，并對這些疾病進行治療干預(yù)。