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2018年，來自德克薩斯大學(xué)的研究者詹姆斯·艾利森（James P.Allison）和日本京都大學(xué)的本庶佑（Tasuku Honjo）兩位科學(xué)家因?yàn)椤鞍l(fā)現(xiàn)抑制負(fù)向免疫調(diào)節(jié)的新型癌癥療法”獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。也就是在同一年，代表性的免疫檢查點(diǎn)抑制劑：PD-1單抗，正式被批準(zhǔn)在國內(nèi)上市。病人常常將以PD-1單抗為代表的藥物稱為“免疫治療藥物”。PD-1單抗在國外的上市時(shí)間是2014年，因此，在2014年之后的4年，這個(gè)藥物被蒙上了神秘的面紗，被稱之為“神藥”。那么，PD-1單抗到底是不是“神藥”？它的作用原理又如何呢？首先研究人員需要知道的是，“腫瘤免疫治療”是一大類的治療手段。其中一個(gè)重要的組成部分是“免疫檢查點(diǎn)抑制劑”，而PD-1單抗，正是免疫檢查點(diǎn)抑制劑的一種。因此，PD-1單抗并不是“腫瘤免疫治療”的全部。腫瘤細(xì)胞為了逃脫免疫細(xì)胞的殺傷，會采用許多種方式。其中有一種方式，就是利用“免疫檢查點(diǎn)”。免疫檢查點(diǎn)分子類似于免疫細(xì)胞的“剎車”。腫瘤細(xì)胞十分“狡猾”，往往在其細(xì)胞表面，高表達(dá)“剎車”分子的配體。這就相當(dāng)于，踩住了“剎車”，使免疫細(xì)胞失去了殺傷腫瘤的能力。在這些“剎車分子”中，PD-L1就是最主要的一種。后續(xù)幾年的研究中也有大量的研究關(guān)于免疫檢查點(diǎn)及其抑制劑，今天小編為大家?guī)硪黄路帧禼ancer cell》上的一篇關(guān)于單細(xì)胞分析揭示了三陰性乳腺癌(TNBC)中與PD-L1阻斷反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群,將免疫檢查點(diǎn)抑制劑與免疫細(xì)胞、癌癥腫瘤亞群關(guān)聯(lián)分析，能為你的研究提供哪些思路呢？
摘要：
在三陰性乳腺癌(TNBC)中，聯(lián)合化療和檢查點(diǎn)抑制劑的好處還不是很清楚。研究人員利用單細(xì)胞RNA和ATAC測序來檢測22例接受紫杉醇或其聯(lián)合抗pd - l1 “atezolizumab”治療的晚期TNBC患者的免疫細(xì)胞。研究人員證明，高水平的基線CXCL13+ T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的促炎特征有關(guān)，可以預(yù)測對聯(lián)合治療的有效反應(yīng)。在應(yīng)答患者中，淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞(LTi)、濾泡B (Bfoc)細(xì)胞、CXCL13+ T細(xì)胞和傳統(tǒng)的Ⅰ型樹突狀細(xì)胞(cDC1)在聯(lián)合治療后一致增加，而紫杉醇單藥治療后相反減少。研究人員的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了CXCL13+ T細(xì)胞對抗pd - l1治療有效應(yīng)答的重要性，并提示紫杉醇方案減少CXCL13+ T細(xì)胞可能會影響atezolizumab聯(lián)合TNBC治療的臨床結(jié)果。
文章亮點(diǎn)：
1.在抗pd - l1治療后TNBC中發(fā)現(xiàn)動態(tài)免疫細(xì)胞改變
2.CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T細(xì)胞可以預(yù)測PD-L1阻斷有效反應(yīng)
3.發(fā)現(xiàn)表達(dá)CXCL9的促炎巨噬細(xì)胞與CXCL13+ T細(xì)胞相關(guān)
4.發(fā)現(xiàn)紫杉醇損害由atezolizumab引起的應(yīng)答免疫細(xì)胞的擴(kuò)張
結(jié)果：
晚期TNBC患者的免疫細(xì)胞動力學(xué)
圖S1
圖S2
研究人員將22例晚期TNBC患者納入本研究，其中半數(shù)采用紫杉醇單藥治療，另一半采用紫杉醇加atezolizumab作為一線治療。免疫治療應(yīng)答者表現(xiàn)出了水平更高的TILs和PD-L1，但并非所有具有這些特征的腫瘤都對抗PD-L1治療有反應(yīng)(圖S1A)，表明有必要解剖免疫治療的機(jī)制。因此，研究人員采用單細(xì)胞測序來描述TNBC患者的免疫特征和動態(tài)，顯示出不同的臨床結(jié)果。在基線、治療開始后4周和疾病進(jìn)展時(shí)共采集了78例腫瘤活檢和血液樣本(圖S2A)。研究人員對活檢樣本進(jìn)行了外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)它們的基因組改變與癌癥基因組圖譜(TCGA)中人類乳腺腫瘤中常見的發(fā)現(xiàn)一致。經(jīng)過高質(zhì)量的篩選，研究人員獲得了489,490個(gè)高質(zhì)量免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括髓系細(xì)胞、固有淋巴細(xì)胞(ILCs)、T細(xì)胞和B細(xì)胞(圖S2B、S1C和S1D)。在聯(lián)合治療組中，B細(xì)胞在應(yīng)答性腫瘤中主要富集，而髓細(xì)胞在非應(yīng)答性腫瘤中富集(圖S1E)。治療后主要免疫細(xì)胞類型的動態(tài)變化，兩組有效治療后B細(xì)胞減少，T細(xì)胞增加。
研究人員建立了兩個(gè)指標(biāo)，預(yù)測指數(shù)(Pi)和治療指數(shù)(Ti)，以系統(tǒng)地研究不同的免疫細(xì)胞類型與臨床反應(yīng)的關(guān)系。Pi測量基線細(xì)胞比例與腫瘤大小變化之間的相關(guān)性，Ti測量細(xì)胞比例動態(tài)與腫瘤大小變化之間的相關(guān)性。Pi或Ti陽性表示基線水平較高或相應(yīng)免疫細(xì)胞亞型的細(xì)胞比例增加與治療后腫瘤大小的更大程度的減小相關(guān)，因此分別預(yù)測或介導(dǎo)了有利的反應(yīng)。Pi陰性或Ti陰性分別表示對應(yīng)的免疫細(xì)胞亞型預(yù)測或介導(dǎo)不利反應(yīng)。
基于Pi分析，研究人員發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞是最顯著的免疫細(xì)胞類型，可以預(yù)測對兩種治療方案的良好反應(yīng)(圖S2C和S1F)，這與關(guān)于B細(xì)胞對ICB反應(yīng)的預(yù)測作用的發(fā)現(xiàn)相一致。在Ti分析中，與化療相比，T細(xì)胞在聯(lián)合治療中明顯表現(xiàn)出Ti陽性(圖S2C和S1F)，這表明atezolizumab可能通過提高T細(xì)胞水平來促進(jìn)有效反應(yīng)。
為了在人類TNBC中生成一個(gè)完整的免疫細(xì)胞圖譜，研究人員進(jìn)一步對來自血液或腫瘤的每個(gè)主要免疫腔室分別重新聚類。研究人員發(fā)現(xiàn)了具有獨(dú)特分子特征的異質(zhì)免疫細(xì)胞亞型，表明了它們獨(dú)特的細(xì)胞身份(圖S2B、S2D和S1G)。
圖1
圖2
CD8-CXCL13和CD4-CXCL13在聯(lián)合治療的TNBC腫瘤中擴(kuò)增
研究人員上述的分析表明，T細(xì)胞可能在PD-L1阻斷治療中發(fā)揮核心作用。基于研究人員在TNBC腫瘤中的高分辨率T細(xì)胞圖，研究人員發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)高表達(dá)PDCD1和CXCL13的T細(xì)胞簇(CD8-CXCL13, CD4-CXCL13);三個(gè)T細(xì)胞群包括naive (Tn)、activated (Tact)和proliferative (Tprf)亞群，其中包含CD8+和CD4+ T細(xì)胞;以及一些典型的CD8+或CD4+ T細(xì)胞簇，包括調(diào)節(jié)性(Treg)、中央記憶(Tcm)、效應(yīng)性(Teff)、效應(yīng)性記憶(Tem)、組織常駐記憶(Trm)和黏膜相關(guān)不變T (MAIT)細(xì)胞亞群(圖1A和1B)。
除了淋巴結(jié)(LNs)中富集的Tn和肝轉(zhuǎn)移部位富集的MAIT外，這些T細(xì)胞亞群沒有顯示出特定的組織偏好(圖1C)。值得注意的是，CD8-CXCL13表達(dá)TIGIT、CTLA4和LAG3的T細(xì)胞耗竭相關(guān)基因，而CD4-CXCL13通過表達(dá)BHLHE40、TOX2和CXCR5，不僅表現(xiàn)出T輔助型1 (Th1)細(xì)胞和T濾泡輔助型(Tfh)細(xì)胞的特征，也表達(dá)了耗盡標(biāo)志物(圖2A)。CD8-CXCL13和CD4-CXCL13的衰竭特征暗示了它們的腫瘤反應(yīng)性，因?yàn)榇饲暗难芯勘砻?，腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞由于持續(xù)的腫瘤抗原刺激而表現(xiàn)出衰竭表型。此外，基于匹配的T細(xì)胞受體(TCR)數(shù)據(jù)，這兩個(gè)亞群與T調(diào)節(jié)細(xì)胞(treg)一起，顯示出顯著的克隆擴(kuò)增，進(jìn)一步表明它們的抗原體驗(yàn)特性(圖1A)。
為了解釋治療后的免疫細(xì)胞動力學(xué)，研究人員首先研究了紫杉醇對不同T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)。與無應(yīng)答者相比，應(yīng)答者在紫杉醇治療后CD8- cxcl13、CD4- cxcl13和Tregs水平降低，CD8+ Tem、Teff和CD4+ Tcm細(xì)胞水平升高(圖2B、2C和S2D)。有趣的是，CD8-CXCL13和CD4-CXCL13在紫杉醇+ atezolizumab治療后的應(yīng)答患者中均擴(kuò)增，導(dǎo)致聯(lián)合治療組中CD8-CXCL13的比例高于單獨(dú)紫杉醇治療后的比例(圖2B, 2C和S2E)。同樣，研究人員的Ti分析也顯示，在反應(yīng)性患者中，聯(lián)合治療后CD8-CXCL13和CD4- CXCL13的表達(dá)增加，而紫杉醇治療后則減少(圖2D和1F)。這些觀察結(jié)果提示CXCL13+ T細(xì)胞與PD-L1阻斷的相關(guān)性。研究人員進(jìn)一步利用TCR序列來追蹤對聯(lián)合治療反應(yīng)的腫瘤中CXCL13+ T細(xì)胞的譜系起源，發(fā)現(xiàn)它們的擴(kuò)增既包含已存在的克隆，也包含新浸潤的克隆(圖2E和2F)。事實(shí)上，考慮克隆TCRs(克隆大小R2)時(shí)，已有克隆的數(shù)量大于新滲透克隆。因此，在治療后，大量已經(jīng)存在的克隆有助于CXCL13+ T細(xì)胞的擴(kuò)展。在BC小鼠模型中，ICB治療后CD8+ PD-1+ LAG3+ T細(xì)胞增加，進(jìn)一步證實(shí)了CD8- cxcl13與ICB治療的相關(guān)性。此外，ICB治療后，CD8+耗盡T (Tex)細(xì)胞的數(shù)量增加(圖1G和1H)也證實(shí)了人類基底細(xì)胞癌(BCC)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)。
圖4
CXCL13+ T細(xì)胞和相關(guān)B細(xì)胞可以預(yù)測抗pd - l1免疫治療的良好反應(yīng)
與聯(lián)合治療的耐藥患者相比，應(yīng)答患者表現(xiàn)出更高的基線CD8- CXCL13和CD4-CXCL13水平(圖2B和2C)，這表明CXCL13+ T細(xì)胞在形成抗pd - l1治療的臨床結(jié)果中具有重要意義。一致地，研究人員的Pi分析也表明，較高水平的CXCL13+ T細(xì)胞可以預(yù)測對聯(lián)合治療更好的反應(yīng)(圖2D)。除了CXCL13+ T細(xì)胞，Tn-LEF1盡管在LNs中特異性富集，但也與兩種治療方案的良好反應(yīng)有關(guān)(圖2D)?；趖cga的分析顯示，與黑色素瘤和肺腫瘤相比，乳腺腫瘤含有更少的浸潤性CD8+ CXCL13+ T細(xì)胞(圖1I)，這與ICB治療BC的低應(yīng)答率一致。研究人員通過多色免疫組化(IHC)染色進(jìn)一步證實(shí)了CD8- CXCL13和CD4-CXCL13 T細(xì)胞在聯(lián)合治療反應(yīng)的腫瘤中存在(圖3A)。TNBC腫瘤中的B細(xì)胞包括兩個(gè)主要的亞群：CD19+ B和血漿B (pB)細(xì)胞(圖4A)，在聯(lián)合治療組中，有應(yīng)答者的基線CD19+ B細(xì)胞水平高于無應(yīng)答者(圖4B)。CD19+ B細(xì)胞高度表達(dá)CXCL13的受體CXCR5 (BCA-1)(圖4A)，表明它們與CXCL13+ T細(xì)胞有潛在的聯(lián)系。的確，在紫杉醇+ atezolizumab應(yīng)答的TNBC腫瘤中，研究人員觀察到CD19+ B細(xì)胞與CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T細(xì)胞共定位(圖3A)。淋巴細(xì)胞聚集表明，這種定位與三級淋巴樣結(jié)構(gòu)(TLS)高度相似，這與最近的研究一致，表明TLS有助于免疫治療反應(yīng)。
此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，在人BCC患者進(jìn)行ICB治療后，CD19+ B細(xì)胞與CD8+ Tex細(xì)胞共同擴(kuò)增(圖1H) 。與CD8+ CXCL13+ T細(xì)胞稀少的TCGA BRCA腫瘤相比，大量CD8+ CXCL13+ T細(xì)胞的TCGA BRCA腫瘤中，含有CD79A和CD19的B細(xì)胞制造者以及CXCR5的高表達(dá)(圖4C)。通過比較應(yīng)答性和非應(yīng)答性腫瘤中B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異，研究人員發(fā)現(xiàn)應(yīng)答性腫瘤中富含高表達(dá)基因的B細(xì)胞參與了抗原處理和呈遞、干擾素(IFN)-g應(yīng)答和T細(xì)胞激活的通路。相比之下，在無應(yīng)答的腫瘤高表達(dá)基因中富集的B細(xì)胞參與了B細(xì)胞激活、免疫球蛋白的產(chǎn)生和體液免疫應(yīng)答的通路(圖3B和4D)。因此，B細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的作用可能主要是激活CXCL13+T細(xì)胞。
聯(lián)合治療后，Bfoc和LTi細(xì)胞在TNBC腫瘤中一致擴(kuò)增
圖5
研究人員發(fā)現(xiàn)CD19+ B細(xì)胞由naive B (Bn)、memory B (Bmem)、Bfoc、增殖Bmem和增殖Bfoc亞群組成，這些亞群沒有顯示出特定的組織富集(圖4A、4E和4F)。值得注意的是，Bn、Bmem和Bfoc細(xì)胞主要富集在紫杉醇+ atezolizumab應(yīng)答的腫瘤中，而在紫杉醇應(yīng)答的腫瘤中不富集(圖5C和4G)。Bfoc細(xì)胞的特征是MEF2B、BCL6、RGS13和NEIL1的高表達(dá)(圖4A和4E) 。在兩組治療中，有應(yīng)答者的基線Bfoc水平明顯高于無應(yīng)答者(圖5C和4G)，研究人員的Pi分析也顯示了Bfoc與良好的臨床反應(yīng)之間的聯(lián)系(圖5D)。對于B細(xì)胞動力學(xué)，研究人員發(fā)現(xiàn)紫杉醇治療應(yīng)答者的Bfoc降低，而紫杉醇加atezolizumab治療應(yīng)答者的Bfoc增加(圖5C、5D和4G、4I)，這表明Bfoc細(xì)胞與atezolizumab治療的相關(guān)性。重要的是，研究人員描述了不同B細(xì)胞亞群的預(yù)后意義，并揭示了Bfoc是與BRCA合并TCGA患者的良好臨床結(jié)局相關(guān)的最顯著的B細(xì)胞亞型(圖5E)。因此，Bfoc似乎是對患者生存和icb免疫治療最重要的B細(xì)胞亞群。
接下來研究人員研究了Bfoc與其他免疫細(xì)胞的聯(lián)系。通過描述相關(guān)的免疫細(xì)胞亞型，研究人員發(fā)現(xiàn)CD4-CXCL13和CD8-CXCL13在細(xì)胞比例上與Bfoc高度相關(guān)，特別是在治療后組(圖5F和4J)。提示Bfoc可能與CXCL13+ T細(xì)胞相互作用，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用。針對配體-受體對，研究人員發(fā)現(xiàn)CXCR5在Bfoc亞群中表達(dá)水平最高，cd40gl - cd40、interleukin -(IL)21-IL21R、IL6ST-EBI3等多對可能介導(dǎo)了Bfoc與CD4-CXCL13之間的作用(圖5G)。有趣的是，以CCR7、IL7R、GPR183、LTB (lymphoxin)、IL23R基因表達(dá)為特征的ldl -like ILC3 (ILC3-IL7R)也與Bfoc具有高度相關(guān)性，在聯(lián)合治療后與Bfoc共同擴(kuò)增，而化療后則沒有(圖5H、5J、4J、4K)。值得注意的是，ILC3-IL7R可以預(yù)測兩種治療方案的良好反應(yīng)(圖5J)，表明其在有效抗腫瘤免疫中的潛在作用。
聯(lián)合治療后，TNBC腫瘤中cDC1擴(kuò)增
圖6
先前CXCL13+ T細(xì)胞在抗pd - l1治療中的重要性促使了研究人員去進(jìn)一步研究CXCL13+ T細(xì)胞如何在某些TNBC患者中被激活和富集。由于TME中的髓細(xì)胞可能調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)，研究人員接下來關(guān)注TNBC腫瘤中的髓系腔室。研究人員觀察了樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞。在這些主要亞群中，研究人員觀察到有應(yīng)答者的DCs水平高于無應(yīng)答者，無論是在基線時(shí)還是在聯(lián)合治療而非化療后(圖6A)，這支持了它們在ICB治療中的作用。
為了確定TNBC腫瘤中DCs的特定亞群，研究人員進(jìn)行了無監(jiān)督聚類，識別了漿細(xì)胞樣DC (pDC)、cDC1、成熟DC (mDC，或LAMP3+ DC)，包括CCR7、LAMP3、CCL19、IDO1和PD-L1，以及三個(gè)常規(guī)DC2 (cDC2)亞群，包括朗格罕細(xì)胞(LCs, cDC2- cd207)、促炎和抗炎cDC2 (cDC2- clec10a, cDC2- fcgr2b)，基于其特征基因(圖S4B S4D;表S2)。有趣的是，較高的基線cDC1和pDC水平可能提示紫杉醇治療有良好的反應(yīng)，但這些DC亞群中沒有一個(gè)可以表明聯(lián)合治療有良好的反應(yīng)，這可能暗示DC亞群不是有效抗pd - l1治療的關(guān)鍵決定因素。
對于不同的DC子集，研究人員接下來檢查了它們在不同治療組中的時(shí)間動態(tài)。與無應(yīng)答者相比，應(yīng)答者在紫杉醇治療后顯示mDC水平下降，這一時(shí)間模式類似于同一治療組中潛在的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞(圖2C和6B)。
“RNA豐度是單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)的有力指標(biāo)。單細(xì)胞RNA測序可以定量、準(zhǔn)確、靈敏、高通量地揭示RNA豐度。然而，這種方法只能在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)捕獲靜態(tài)快照，這對分析胚胎發(fā)生或組織再生等隨時(shí)間變化的現(xiàn)象提出了挑戰(zhàn)。在這里，證明了RNA速度——基因表達(dá)狀態(tài)的時(shí)間導(dǎo)數(shù)——可以通過區(qū)分普通單細(xì)胞RNA測序中未剪接和剪接的mrna來直接估計(jì)。RNA速率是一種高維的載體，可以在數(shù)小時(shí)的時(shí)間尺度上預(yù)測單個(gè)細(xì)胞的未來狀態(tài)。在神經(jīng)嵴譜系中驗(yàn)證了它的準(zhǔn)確性，展示了它在多個(gè)已發(fā)表的數(shù)據(jù)集和技術(shù)平臺上的應(yīng)用，揭示了發(fā)育中的小鼠海馬的分支譜系樹，并檢測了人類胚胎大腦中的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)?！?/p>
盡管根據(jù)RNA速度分析，cDC1和促炎cDC2均可轉(zhuǎn)化為mDC，這與人類肝癌和肺癌的研究結(jié)果一致；在TNBC腫瘤中，mDC與cDC1緊密連接，這是由于它們的轉(zhuǎn)錄相似性和細(xì)胞比例的動態(tài)變化相關(guān)(圖6C和6D)。對于紫杉醇+ atezolizumab治療的患者，研究人員還觀察到，與cDC1和pDC的增加相比，應(yīng)答者治療后mDC減少，這可能是由于紫杉醇方案選擇性減少了mDC(圖6B)。重要的是，與紫杉醇單獨(dú)治療相比，紫杉醇聯(lián)合atezolizumab治療應(yīng)答患者后發(fā)現(xiàn)更高水平的cDC1、mDC和pDC，表明它們參與了抗pd - l1治療。
研究人員的Ti分析進(jìn)一步表明，cDC1和pDC與聯(lián)合治療的良好反應(yīng)有關(guān)，而與化療無關(guān)(圖6E)。值得注意的是，同時(shí)使用atezolizumab時(shí)，紫杉醇治療后mDC的減少被抑制，這表明它與PD-L1阻斷有關(guān)。值得注意的是，mDC和cDC1都表現(xiàn)出與CD4-CXCL13協(xié)調(diào)的時(shí)間動態(tài)(圖6D)，研究人員通過TCGA BRCA的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)證實(shí)了它們的相關(guān)性(圖6F)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了多種配體-受體對，包括CD40LG-CD40，它們可能介導(dǎo)了mDC、cDC1和CD4-CXCL13之間的串?dāng)_(圖6G)。有趣的是，根據(jù)細(xì)胞比例中mDC、cDC1和CD4-CXCL13的時(shí)間動態(tài)，CD8-CXCL13也顯示出高相關(guān)性(圖6D)。這些觀察表明，CD4- cxcl13和CD8- cxcl13可能同時(shí)被cDC1或mDC激活，最近的研究表明同源CD4+ T細(xì)胞許可cDC1誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞免疫。
巨噬細(xì)胞的表型與T細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)
針對單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞室，研究人員發(fā)現(xiàn)，與聯(lián)合治療組相比，無應(yīng)答組的巨噬細(xì)胞(Mf)基線水平更高，且無應(yīng)答組的巨噬細(xì)胞高表達(dá)SPP1、TREM2、FN1和C3，而應(yīng)答組的巨噬細(xì)胞高表達(dá)CXCL9、MMP9、和PLA2G2D(圖6A和7A)。值得注意的是，已證明TREM2和SPP1在抗炎腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)中表達(dá)。進(jìn)一步的非監(jiān)督聚類顯示了廣泛的異質(zhì)性，導(dǎo)致單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的多個(gè)亞群。單核細(xì)胞亞群高表達(dá)FCN1、S100A8和S100A9，而巨噬細(xì)胞亞群高表達(dá)CD68、APOE和C1Qs，類似于tam的特征。值得注意的是，TNBC腫瘤中的巨噬細(xì)胞亞群傾向于共同表達(dá)規(guī)范M1和M2信號(圖1e)，這與最近在人類乳腺癌和肺癌中的發(fā)現(xiàn)一致。為了了解CXCL13+ T細(xì)胞是如何被其他免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的，研究人員利用TCGA BRCA數(shù)據(jù)來檢測CD8A和CXCL13高表達(dá)的乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)錄特征。果然，一組免疫相關(guān)基因被鑒定出來(圖7B)。
為了估計(jì)伴隨有潛在腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫細(xì)胞亞型的存在，研究人員在排除T細(xì)胞和B細(xì)胞標(biāo)記后，檢測了上述基因在骨髓細(xì)胞亞群中的表達(dá)。值得注意的是，兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群，Mf-CCL2和Mf-MMP9，以及mDC和其他DC亞型，都是排名最高的免疫亞型(圖5C)，表明它們與CXCL13+ T細(xì)胞相關(guān)。Mf-MMP9亞群高表達(dá)PLA2G2D、IL2RG和CXCL9，而Mf-CCL2高表達(dá)CXCL9、CXCL10和CXCL11(圖7D)。CXCL9和CXCL10是已知的介導(dǎo)T細(xì)胞招募的趨化因子，它們在Mf-MMP9和Mf-CCL2中的高表達(dá)支持這兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群的促炎特性。除了上述基于轉(zhuǎn)錄組的分析，研究人員還檢測了免疫細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)MfCCL2和Mf-MMP9也與CXCL13+ T細(xì)胞高度相關(guān)(圖7E)。值得注意的是，這兩種巨噬細(xì)胞亞群的高基線水平表明聯(lián)合治療的良好反應(yīng)(圖7F)。分析顯示，Mf-CCL2和Mf-MMP9的關(guān)鍵特征基因，包括CXCL9和CXCL10，與IFNG和TNF相關(guān)(圖7G)，表明TME中積極的抗腫瘤免疫反應(yīng)可能重塑了巨噬細(xì)胞的蛋白炎性表型。與無應(yīng)答者相比，研究人員一致觀察到在紫杉醇加atezolizumab應(yīng)答的腫瘤中Mf-MMP9和CD8-CXCL13同時(shí)富集(圖7H)。與Mf-CCL2和Mf-MMP9相比，Mf-MKI67、Mf-SLC40A1和Mf-MGP的基線水平與Tregs呈正相關(guān)，而Mf-CX3CR1、Mf-TUBA1B和Mf-FOLR2與CXCL13+ T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。這些亞群高表達(dá)SPP1和TREM2，類似于研究人員之前在人類結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)的SPP1+ TAMs ，因此代表抗炎巨噬細(xì)胞。根據(jù)研究人員的Pi分析，研究人員觀察到它們在對聯(lián)合治療無反應(yīng)的腫瘤中富集(圖7F)。
對于不同治療后巨噬細(xì)胞亞群的動態(tài)變化，研究人員發(fā)現(xiàn)紫杉醇方案選擇性地減少了Mf-CCL2和Mf-MMP9的促炎巨噬細(xì)胞，但增加了應(yīng)答患者的免疫抑制巨噬細(xì)胞，而atezolizumab似乎對巨噬細(xì)胞亞群影響不大(圖7F)。這些結(jié)果表明紫杉醇可能具有免疫抑制的TME。為了促進(jìn)臨床應(yīng)用生物標(biāo)志物的開發(fā)，研究人員通過構(gòu)建評分分類器進(jìn)一步評估CXCL13+ T細(xì)胞和Mf-MMP9關(guān)鍵特征基因的預(yù)測性能，發(fā)現(xiàn)了一組具有高預(yù)測潛力的標(biāo)志物(圖7I)。因此，核心抗腫瘤免疫亞群的關(guān)鍵特征基因可以作為預(yù)測ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物。
CD8-CXCL13在抗pd - l1治療后細(xì)胞毒性增強(qiáng)
考慮到CXCL13+ T細(xì)胞在抗pd - l1治療中的重要性，研究人員接下來研究了其治療誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄動態(tài)。值得注意的是，根據(jù)RNA速度和TCR共享分析，CD8- cxcl13與CD8+ Tem細(xì)胞有譜系聯(lián)系。轉(zhuǎn)錄組分析顯示IFNG、GZMK、GZMA和CD44的效應(yīng)基因和記憶相關(guān)基因;TBX21、BHLHE40和BCL6的轉(zhuǎn)錄因子(TFs);CD28和ICOS共刺激分子;CD8-CXCL13治療后，HLA基因和整合素上調(diào)，而耗竭相關(guān)基因，包括HAVCR2、LAYN、TIGIT和LAG3下調(diào)(圖8A)。CD8-CXCL13表型的轉(zhuǎn)移還體現(xiàn)在其衰竭評分降低和效應(yīng)記憶評分增加(圖8B)。此外，CD8-CXCL13治療后上調(diào)的基因參與了T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抗原加工呈提及IFN-g介導(dǎo)的信號通路的正調(diào)控通路，進(jìn)一步說明PD-L1阻斷治療后其效應(yīng)增強(qiáng)。
此外，研究人員還進(jìn)行了單細(xì)胞ATAC-seq (scATAC-seq)檢測，以檢查染色質(zhì)可及性的變化，并從5個(gè)樣本中獲得了30,758個(gè)免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)，包括來自紫杉醇加atezolizumab治療的應(yīng)答患者的配對樣本。根據(jù)研究人員的scacac -seq和單細(xì)胞RNA-seq (scRNA-seq)數(shù)據(jù)的綜合分析確定了免疫細(xì)胞亞型。不同亞群的特征基因的染色質(zhì)可及性證實(shí)了它們的細(xì)胞特性。CD8- cxcl13細(xì)胞的表觀遺傳特征與此前在小鼠模型、人類黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌中研究的CD8+ Tex細(xì)胞特征一致(圖8C)。與其他T細(xì)胞亞型的染色質(zhì)可及性相比，CD8- cxcl13和CD8+ Tem更為相似，這證實(shí)了它們在譜系分化的連續(xù)譜中存在聯(lián)系。具體來說，CD8- cxcl13和CD8+ Tem在IFNG、GZMK和PDCD1位點(diǎn)上都有開放染色質(zhì)區(qū)域(ocr)。然而，CD8-CXCL13表現(xiàn)出與CD8+ Tem不同的細(xì)胞狀態(tài)，這是因?yàn)樗鼈冊贑XCL13、CTLA4和LAYN中富集了ocr(圖8C和S7G)。接下來，研究人員通過比較聯(lián)合治療前后配對的scATAC-seq數(shù)據(jù)，研究了CD8+ Tem、CD8- cxcl13和CD4-CXCL13染色質(zhì)可及性的整體動態(tài)。此外，差異可達(dá)峰中TF結(jié)合motif (TFBMs)的過度表達(dá)也證實(shí)了CD8-CXCL13的表型變化，預(yù)處理組CREM和RBPJ的TFBMs趨于富集，而TBX21、EOMES和PRDM1的TFBMs在處理后組中富集(圖8E)。因此，染色質(zhì)可及性動態(tài)研究的結(jié)果與基于轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果一致，都支持CD8-CXCL13在聯(lián)合治療后的效應(yīng)特性增強(qiáng)。
接下來，研究人員系統(tǒng)地研究了血液中的T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在基線時(shí)應(yīng)答者體內(nèi)增殖的T細(xì)胞富集，但在聯(lián)合治療后降低，可能是由于紫杉醇的影響。值得注意的是，研究人員沒有在血液中觀察到CXCL13+ T細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合治療后的應(yīng)答患者中，血液CD8+ Tem細(xì)胞與腫瘤CD8-CXCL13的TCR克隆水平較高，且遷移指數(shù)也較高(圖8F)。這些觀察表明，PD-L1阻斷治療后的應(yīng)答患者可誘導(dǎo)可檢測的全身免疫應(yīng)答。
文章小結(jié)：
到這里文章就結(jié)束了，研究人員利用單細(xì)胞RNA測序(RNA-seq)和ATAC測序(ATAC-seq)技術(shù)來描述22例接受紫杉醇或其聯(lián)合atezolizumab治療的TNBC患者免疫細(xì)胞的細(xì)胞和分子動力學(xué)特征，分子對接，分子動力學(xué)模擬也是生物科學(xué)課題中經(jīng)常會用到的技術(shù)。研究人員發(fā)現(xiàn)了抗pd - l1治療的耐藥和敏感性的基礎(chǔ)，確定了對atezolizumab的應(yīng)答免疫細(xì)胞亞型，并提出了紫杉醇聯(lián)合atezolizumab在TNBC治療中的潛在缺陷。在免疫細(xì)胞的亞型分類以及臨床免疫治療中做出了巨大推進(jìn)。
