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小編最近在NATURE COMMUNICATIONS（最近一年的影響因子為：14.919。比上一年增加了2.798)）這篇雜志上看到一篇單細(xì)胞測(cè)序的文章，《Single-cell analysis of diverse immune phenotypes in malignant pleural effusion》。最近的單細(xì)胞測(cè)序的狂熱自不必多說，但是除了單細(xì)胞測(cè)序這個(gè)熱點(diǎn)外，小編的第一反應(yīng)是，這個(gè)樣本極容易獲得。值得我們學(xué)習(xí)。
背景知識(shí)：
不同免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用在惡性胸腔積液的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在這里，作者對(duì)非小細(xì)胞肺癌誘發(fā)的MPE患者的62,382個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，以描述MPE中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的組成、譜系和功能狀態(tài)。與血液中相應(yīng)的免疫細(xì)胞相比，MPE中的免疫細(xì)胞表現(xiàn)出大量富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征。
malignant pleural effusion (MPE)：惡性胸腔積液
結(jié)果解讀：
為了研究mpE環(huán)境的免疫學(xué)特征，作者采用基于液滴的ScRNA-seq技術(shù)研究了MPE和血液中免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜(Fig.1a)。在對(duì)讀取深度和線粒體讀取計(jì)數(shù)進(jìn)行基因表達(dá)歸一化的定性篩選后，仍有62,382個(gè)細(xì)胞可檢測(cè)到200-6,000個(gè)基因，以供后續(xù)分析。其中，33,089個(gè)細(xì)胞和29,293個(gè)細(xì)胞分別來自MPE和血液(Fig.1b)。通過分級(jí)聚類將19個(gè)表達(dá)組分組，從而確定了T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的主要細(xì)胞室的特征，其中最豐富的MPE免疫細(xì)胞是T細(xì)胞(Fig.1c–e)。對(duì)于MPE和血液中各細(xì)胞類型的差異表達(dá)基因，作者采用基因集富集分析，確定與MPE相關(guān)的途徑。作者發(fā)現(xiàn)，MPE的糖酵解途徑以及細(xì)胞增殖和免疫反應(yīng)信號(hào)明顯較高(Fig.1f)。在免疫細(xì)胞類型中，T細(xì)胞在MPE中顯著富集，而NK細(xì)胞在血液中顯著富集(Fig.1g)。
根據(jù)細(xì)胞譜系和功能狀態(tài)，T細(xì)胞亞群被鑒定為CD4+T細(xì)胞(初始CD4+T細(xì)胞、Th1/17細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞[Tfh]細(xì)胞和Treg細(xì)胞)；CD8+T細(xì)胞(初始T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗盡T細(xì)胞)；增殖的T細(xì)胞，既有CD4+T細(xì)胞，也有CD8+T細(xì)胞(Fig.2a, b)。與先前在NSCLC中的發(fā)現(xiàn)一致，作者還發(fā)現(xiàn)MPE中細(xì)胞毒性T細(xì)胞的耗竭和Treg細(xì)胞的出現(xiàn)(Fig.2c)。
為了了解T細(xì)胞亞型之間的狀態(tài)轉(zhuǎn)換，作者使用Destiny繪制擴(kuò)散圖，以數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)構(gòu)建T細(xì)胞亞型的潛在發(fā)育軌跡。從表達(dá)數(shù)據(jù)或標(biāo)記基因推斷的發(fā)育軌跡表明，初始T細(xì)胞最終通過CD8+T細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞進(jìn)入耗竭狀態(tài)(Fig.2d)。在CD4+T細(xì)胞中，初始T細(xì)胞位于與Tfh細(xì)胞和Treg細(xì)胞相對(duì)的一端，Th1/17細(xì)胞主要位于中心(Fig.2e)。 PDCD1是一個(gè)重要的免疫檢查點(diǎn)靶點(diǎn)，在Tfh中高表達(dá)，提示Tfh細(xì)胞也可能是PD1抑制劑在MPE中的效應(yīng)細(xì)胞之一。79.7%的CD4+T細(xì)胞表達(dá)αβT細(xì)胞受體，其中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率為78.5%。在CD8+T細(xì)胞中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗盡的T細(xì)胞之間存在顯著的共享TCR (Fig.2f)。在每個(gè)樣本中都發(fā)現(xiàn)了這些共享的TCR，這表明T細(xì)胞增殖是MPE的常見現(xiàn)象，而不是某些癌癥患者的特征。作者將這些與細(xì)胞毒T細(xì)胞共同表達(dá)TCR的耗竭T細(xì)胞標(biāo)記為耗竭c1簇，將未擴(kuò)增的耗竭T細(xì)胞標(biāo)記為c2。此外，作者還表明，與CD4+T細(xì)胞中的耗竭簇Tfh特征相結(jié)合，能夠區(qū)分高耗竭-C1特征的患者的預(yù)后(Fig.2g)。
根據(jù)典型B細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和分布，作者鑒定了7個(gè)CD19+B細(xì)胞亞群和4個(gè)漿細(xì)胞亞群。血漿B細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白γ(IGHG)和XBP1(Fig.3a–c)。為了進(jìn)一步研究B細(xì)胞的差異轉(zhuǎn)錄變化，作者比較了MPE中Breg細(xì)胞和幼稚B細(xì)胞的表達(dá)譜。作者分別比較了MPE和血液中幼稚B細(xì)胞和Breg的差異基因。作者得出的結(jié)論是，MPE中幼稚B細(xì)胞和Bregs基因表達(dá)的最高水平上調(diào)具有相似的富集模式。與血液中的相應(yīng)細(xì)胞相比，MPE中的幼稚B細(xì)胞和Breg細(xì)胞表達(dá)更多的糖代謝信號(hào)(PKM、TPI1、ENO1和LDHA)、缺氧反應(yīng)(NR4A2、CXCR4和HIF1A)和細(xì)胞增殖信號(hào)(H3F3B、MIF和ZFP36L2)。TNFRSF13B、ITGB1和LGALS1基因在Breg細(xì)胞中均顯著高表達(dá)(Fig.3d)，提示Breg細(xì)胞具有通過細(xì)胞間相互作用調(diào)節(jié)T細(xì)胞等其他重要免疫細(xì)胞的功能。為了探索Breg細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用，作者研究了特定的配體-受體是否參加Breg細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞亞群之間的相互作用。作者的數(shù)據(jù)顯示，在MPE中，Breg細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間的預(yù)測(cè)相互作用的數(shù)量顯著減少。Breg細(xì)胞的細(xì)胞間通訊以CD4+T細(xì)胞為主，包括Th1/17、Treg和Tfh(Fig.3e)。
作者檢測(cè)了髓系細(xì)胞的典型標(biāo)記基因，并在MPE和血液中鑒定出簇。標(biāo)記基因CD14、FCGR3A和CD68的高表達(dá)定義了7個(gè)單核/巨噬細(xì)胞簇。CD1C、CLEC10A和FCGR1A的高表達(dá)標(biāo)志著兩個(gè)樹突狀細(xì)胞(DC)簇(Fig.4a–c)。作者檢查了巨噬細(xì)胞群中M1和M2狀態(tài)的標(biāo)記基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MPE巨噬細(xì)胞高表達(dá)M2標(biāo)記基因(Fig.4d)。這表明M1/M2分類與基于基因表達(dá)的單核/巨噬細(xì)胞亞類無明顯關(guān)系。與單核細(xì)胞相比，巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答、抗原提呈和糖酵解途徑活性顯著增強(qiáng)(Fig.4e)。DC有兩個(gè)亞群：MPE中富含DC-C7，并具有較高水平的免疫激活基因MIF、ALOX5、CKLF和CD1s (Fig.4f)。作者分析了MPE中巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的軌跡，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞有各自的軌跡狀態(tài)，表明腫瘤浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞不同于單核細(xì)胞(Fig.4g)。
與血液相比，MPE中Tfh和巨噬細(xì)胞中代謝途徑的表達(dá)增加最多(Fig.5a)。幾乎所有的MPE細(xì)胞類型都上調(diào)了糖酵解相關(guān)代謝基因的表達(dá)；這些免疫細(xì)胞亞型的這種普遍的代謝特征與胸腔積液中的缺氧環(huán)境是一致的(Fig.5b)。在利用MPE中高表達(dá)基因繪制的糖酵解代謝路徑圖中，作者發(fā)現(xiàn)了一些限速基因，如ashk、pfk和pk，從而進(jìn)一步證實(shí)了MPE中Tfh細(xì)胞的糖酵解代謝被激活(Fig.5c)。此外，戊糖磷酸途徑明顯下調(diào)，而OXPHOS和脂肪酸氧化略有上調(diào)，這與MPE巨噬細(xì)胞M2極化表型一致(Fig.5b)。 綜上所述，免疫細(xì)胞的這些代謝表型可能有助于建立它們與其他細(xì)胞相互作用和調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的功能。
此前，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已經(jīng)在中國人群中確定了54個(gè)與非小細(xì)胞肺癌易感性相關(guān)的基因。作者在MPE中通過已經(jīng)確定的簇進(jìn)一步分析了這些基因，發(fā)現(xiàn)了預(yù)期的和令人驚訝的簇特定的表達(dá)模式(Fig.6)。BPTF在NK細(xì)胞和T細(xì)胞中高表達(dá)，抑制NK細(xì)胞活性，降低T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。作者的結(jié)果還表明，腫瘤患者免疫細(xì)胞中易感基因的表達(dá)發(fā)生了變化，提示這些單核苷酸多態(tài)性和易感基因可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
接下來，作者評(píng)估了特定免疫細(xì)胞類型對(duì)MPE形成的作用。在胸腔中，淋巴細(xì)胞通過重要的信號(hào)分子，如趨化因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，控制血管活性事件的發(fā)生和MPE的發(fā)展。與低表達(dá)的患者相比，高表達(dá)趨化因子信號(hào)的患者的總體存活率明顯較低(Fig.7)。盡管對(duì)這些重要信號(hào)通路在MPE形成過程中的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，但它們與MPE診斷和治療的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。作者的研究結(jié)果支持趨化因子信號(hào)的細(xì)胞特異性表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。
全文小結(jié)：
在本研究中，作者在單細(xì)胞水平上對(duì)人MPE中的免疫細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)的分子描述，繪制了MPE和血液中免疫細(xì)胞的頻率和分子狀態(tài)的差異。具體地說，作者注意到MPE中Treg細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加，并顯示了對(duì)MPE重要的轉(zhuǎn)錄細(xì)胞狀態(tài)，主要包括Tfh細(xì)胞和Breg細(xì)胞。此外，作者在MPE環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了Breg細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞的特異性細(xì)胞間通訊，并且發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑在MPE免疫細(xì)胞中普遍上調(diào)?？傊@項(xiàng)研究提供了來自復(fù)雜MPE微環(huán)境的免疫細(xì)胞的全局圖像，并描繪了免疫細(xì)胞不同于血液免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征活動(dòng)。作者的數(shù)據(jù)可以作為后續(xù)深入研究的資源，以完成更深層次的生物學(xué)探索，并為晚期非小細(xì)胞肺癌的免疫治療提供治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。
