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如何用生信分析解讀單個分子？
今天給介紹一篇發(fā)表在期刊: Oncoimmunology的文章，該期刊在最近一年的影響因子為 8.11，比上一年增加了2.241分。該篇文章最大的特色是講重點放在一個具體的分子上，值得我們學習。
轉移和免疫抑制是口腔鱗狀細胞癌(OSCC)預后不良的原因之一。YKT6是可溶性NSF附著蛋白受體(SNARE)家族的成員，其在口腔鱗癌中的作用尚不清楚。
WGCNA將紅色模塊確定為關鍵模塊，并對紅色模塊中的基因進行了功能鑒定
模塊性狀相關熱圖顯示，口腔鱗癌中紅色模塊與PN分期和CD8+T細胞浸潤高度相關(Figure 1a)。這意味著紅色模塊中的基因可能是OSCC惡性腫瘤和預后的原因。因此，紅色模塊被確定為關鍵模塊。生物過程分析表明，紅色模塊中的基因在細胞外基質的組織、轉化生長因子-β受體信號通路的調控以及細胞外信號轉導等過程中都得到了豐富的表達。KEGG通路分析表明，這些基因與細胞外基質-受體相互作用和局部黏附有關(Figure 1b-c)。這些結果表明，這些基因可能介導了口腔鱗癌中的TME。
YKT6基因被選為影響口腔鱗癌患者預后的HUB基因
大多數(shù)DEGs在口腔鱗癌患者的癌癥標志物中上調。來自GSE13601的基因表達譜發(fā)現(xiàn)，與正常對照組織相比，口腔鱗癌樣本中有946個DEG上調。在這項研究中，紅色模塊中連接性最高的100個基因與946個deg相交，產(chǎn)生29個候選基因(Figure 2a)。為驗證29個候選基因對預后的影響，將GSE42743隊列中的患者按29個基因表達高低分組，采用“Survminer”軟件包獲得的截斷值，進行K-M生存分析和log-ranch檢驗。發(fā)現(xiàn)24個基因對患者的OS有統(tǒng)計學意義上的顯著影響。在GSE41613和TCGA隊列中執(zhí)行上述篩選步驟后，作者使用來自訓練集的相同截止值，最終得到可能影響OS和PFS結果的6個基因(YKT6、PLAU、BASP1、ANXA5、LGALS1和TGFBI） (Figure 2b）。在TCGA數(shù)據(jù)集中，SWSFS算法識別出一個組合了兩個基因的模型(YKT6, PLAU; Figure 2c) 。有一個基因(YKT6)在大多數(shù)癌癥中很少被報道，根據(jù)預后重要性排在榜首(Figure 2d)。在單因素Cox回歸分析中，YKT6的表達具有統(tǒng)計學意義。此外，在使用GSE41613、GSE42743和TCGA數(shù)據(jù)的多變量Cox比例風險回歸模型中，YKT6的表達被認為是一個獨立的預后生物標志物( Figure 2e)YKT6已被證實在分泌途徑的多個膜轉運步驟中發(fā)揮重要作用，其功能障礙可能與腫瘤的惡性進展有關。值得注意的是，YKT6在癌癥中的表達和功能，包括參與免疫相關的過程，在很大程度上仍不清楚。因此，YKT6被選為進一步研究的候選基因。根據(jù)當前研究中開發(fā)的諾模圖計算分數(shù)來預測單個患者的1、3、5和7年的OS(Figure 2g)。校正曲線圖表明，諾模圖在根據(jù)理想模型預測患者OS方面表現(xiàn)良好(Figure 2h)。不出所料， nomogram模型預測OS的一致性指數(shù)在TCGA、GSE41613和GSE42743隊列中分別為0.612、0.705和0.631。此外，AUC值顯示，在所分析的因素中，YKT6的表達與腫瘤分期有關，對OS的預測效果最好(Figure 2i-k)。
YKT6在侵襲性HNSCC/OSCC中的表達升高
首先，探討YKT6在HNSCC惡性中的作用。在MEXPRESS中，根據(jù)不同的臨床因素(包括解剖腫瘤的分類、治療后的疾病復發(fā)、EGFR狀態(tài)、HPV狀態(tài)、腫瘤組織學分級、新腫瘤的出現(xiàn)、是否有神經(jīng)浸潤和吸煙史)，YKT6呈現(xiàn)出不同的表達模式(Figure 3a)?？ǚ綑z驗和Fisher‘s精確檢驗結果顯示，YKT6的表達與亞型有關(Figure 3b）UALCAN檢測結果表明，高病理分級、HPV陰性和TP53突變狀態(tài)的患者YKT6mRNA表達增加Figure 3c-e)。YKT6在間葉型、非免疫型、免疫型3型和創(chuàng)面愈合亞型中的表達明顯高于非典型型、主動免疫型、免疫型4型和干擾素-γ顯性亞型，這反映了YKT6可能參與了轉移和侵襲，并在免疫冷表型中富集（Figure 3f-i)。此外，基于包含167個腫瘤樣品和45個正常樣品的大規(guī)模OSCC數(shù)據(jù)集，YKT6在腫瘤組織中的表達高于正常組織（Figure 3j）在來自GSE78060的轉移性LN組中也得到了類似的結果 （Figure 3k)。在GSE30784和GSE41613數(shù)據(jù)集中，通過估計分析，作者發(fā)現(xiàn)YKT6與腫瘤純度呈正相關。與免疫評分呈負相關 （Figure 3l-m)。綜上所述，這些結果表明YKT6過表達與HNSCC/OSCC的進展、復發(fā)、免疫功能障礙和不良預后有關。此外，對YKT6進行了基因組變異分析，發(fā)現(xiàn)YKT6存在深度缺失、淺層缺失、二倍體、拷貝數(shù)增加和擴增。值得注意的是，在TCGA-HNSCC組織中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)YKT6的拷貝數(shù)增加和擴增（Figure 3n)。YKT6基因拷貝數(shù)與mRNA表達水平呈顯著正相關（Figure 3o）。YKT6的CNV在染色體上的位置如 Figure 3p所示。作者還發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中YKT6的DNA甲基化水平降低 （Figure 3q)，并且YKT6mRNA的表達與cg44201263和cg44209692探針的甲基化水平呈弱負相關（Figure 3r)。WB和IHC染色蛋白水平結果與YKT6 mRNA水平的變化一致。WB顯示YKT6在OSCC組織中的表達水平高于癌旁組織 (Figure 4a)。免疫組化染色顯示，YKT6蛋白的表達隨PN分期的升高而增加，在配對的癌旁組織中的表達低于口腔鱗癌組織。此外，有轉移灶的LN組織中YKT6蛋白水平高于鄰近無轉移腫瘤的正常LN組織中的YKT6蛋白水平(Figure 4b-f)。腫瘤分級越高，預后越差，在兩種組織芯片中，YKT6蛋白的表達隨著口腔鱗癌的惡性進展而增加(通過組織學分級的變化來表示) (Figure 4g-i)。
YKT6被發(fā)現(xiàn)參與口腔鱗癌中與癌癥相關的信號通路
利用GSE30784和GSE41613數(shù)據(jù)進行GSVA分析，探討YKT6與生物學功能之間的關系。YKT6高劑量組細胞外基質、轉化生長因子-β信號、缺氧、腫瘤信號轉導途徑、蛋白質分泌和輸出、腫瘤壞死因子-α信號通過NF-κB顯著增加。YKT6低表達組與T、B細胞受體信號通路顯著相關 (Figure 4j-k)。這些發(fā)現(xiàn)與圖1b-c所示的上述結果是一致的?；谶@些發(fā)現(xiàn)，作者得出結論，YKT6在口腔鱗癌的惡性進展過程中起著重要作用。
YKT6在體外促進OSCC細胞的遷移和侵襲
傷口愈合實驗表明，YKT6的敲低抑制了細胞遷移能力(Figure 5a-d)。Transwell分析，包括遷移和侵襲分析表明，當YKT6耗盡時，細胞的遷移能力和侵襲能力都降低了 (Figure 5e-j)。一些研究報道基質金屬蛋白酶(MMPs)促進癌細胞在口腔鱗癌中的遷移和侵襲，包括MMP9。如 Figure 5k-m所示，隨著YKT6基因敲除，口腔鱗癌細胞MMP9蛋白表達降低。通過上述生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，YKT6的表達與轉化生長因子-β信號通路密切相關，轉化生長因子-β1被認為是口腔鱗癌遷移和侵襲的關鍵啟動者。有趣的是，當YKT6被下調時，轉化生長因子-β-1的分泌減少 (Figure 5n-p)。這些結果證實了YKT6可能在口腔鱗癌的體外遷移和侵襲過程中起重要作用。
YKT6高表達與低CD8+T細胞水平相關
在此基礎上，作者探討了YKT6與CD8+T細胞的關系。TIMER2檢測結果顯示，HNSCC中YKT6mRNA的高表達與CD8+T細胞水平呈顯著負相關 (Figure 6a)。此外，YKT6 CNV的變化改變了CD8+T細胞的水平 (Figure 6b)。此外，作者還評估了YKT6mRNA表達/CNV與TCGA-HNSCC隊列中其他五種免疫細胞浸潤水平的關系。YKT6的表達與B細胞水平的關系值得關注。接下來，作者使用幾種算法在口腔鱗癌中進行后續(xù)研究，在GSE30784和GSE41613數(shù)據(jù)集中，YKT6的表達與CD8+T細胞水平呈負相關(Figure 6c-e)。YKT6的高表達與B細胞和漿細胞水平低有關。除轉錄水平的結果外，免疫組化染色證實，隨著YKT6蛋白表達的增加，CD8(代表腫瘤浸潤的CD8+T細胞)的蛋白水平降低（Figure 6f-h）。由于趨化因子和趨化因子受體介導了TME中免疫細胞的運動，包括CD8+T細胞向腫瘤的募集。作者發(fā)現(xiàn)YKT6與HNSCC和OSCC中CCL5、CCR5、CCR2、CXCR3和CXCL9的表達呈高度負相關(Figure 6i-k)?？傊?，這些結果表明YKT6可能是腫瘤免疫微環(huán)境改變，特別是與CD8+T細胞相關的改變的一個潛在的生物標志物。
YKT6表達可預測ICB的臨床療效
為了進一步闡明YKT6在免疫治療(以ICBS為代表)中的作用，作者將分析擴展到YKT6與幾個眾所周知的免疫檢查點基因之間的關聯(lián)。在TCGA-HNSCC隊列中，YKT6的表達與PD-1、CTLA-4、IDO1、BTLA、LAG-3、TIM-3、TIGIT和Vista的表達呈負相關(Figure 6l)。在GSE30784和GSE41613中有很強的一致性(Figure 6m-n).接下來，作者分析了口腔鱗癌患者ICBS的臨床療效。據(jù)報道，當CD8+T細胞被激活時，以及在抗PD-L1和抗CTLA-4免疫療法的應答過程中，細胞毒性、抗原呈遞和擴大的免疫水平顯著升高。作者發(fā)現(xiàn)，隨著YKT6表達的增加，GSE30784和GSE41613隊列中的CYT、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)比例、檢查點水平、人類白細胞抗原(HLA)豐度、擴大免疫、抗原提呈細胞(APC)共刺激水平和T細胞共刺激水平均下降(Figure 7a)。潮汐評分與YKT6表達的增加顯著相關(Figure 7b)。免疫治療有效的患者口腔鱗癌組織中YKT6的表達低于免疫治療無效的患者口腔鱗癌組織中YKT6的表達 (Figure 7c)。作者進一步研究了YKT6表達和IPS之間的關系，IPS是確定免疫原性決定因素和描述腫瘤內免疫狀況的一個更好的預測因子。在GSE30784和GSE41613中，YKT6的表達與主要組織相容性復合體(MHC)評分、效應細胞(EC)評分和IPS評分呈負相關。關于抑制細胞(SC)評分，得到了相反的結果(Figure 7d-e)。此外，作者通過亞類圖譜的方法研究了YKT6高表達和低表達的口腔鱗癌患者對特異性CTLA-4和PD-1免疫治療的反應。有趣的是，YKT6低表達的患者對抗PD-1治療有良好的反應，而YKT6高表達的患者對抗PD-1治療無反應(Figure 7f-g)。以上分析提示，YKT6低表達患者可能比YKT6高表達患者對ICB治療更敏感。為了進一步了解與患者預后相關的不同免疫因素，作者通過比較YKT6表達與TEDER和IPS評分的時間依賴性AUC值，確定YKT6表達預測OS的準確性。這兩個隊列中的這些分析表明，YKT6在預測口腔鱗癌患者生存方面比TEDE和IPS評分更好(Figure 7h-i)。在GSE35640和GSE91061數(shù)據(jù)集中，作者調查了YKT6是否可以預測患者對ICB治療的反應。正如預期的那樣，與YKT6表達較低的患者相比，YKT6表達較高的患者從免疫檢查點治療中獲益的可能性較小(Figure 7j-k)，并測定了AUC值(>0.600)對預測客觀反應的敏感性和特異性(Figure 7l-m)。
YKT6在人類癌癥中的研究概況
考慮到YKT6相關腫瘤研究的缺乏，特別是在實體瘤中，作者評估了YKT6在31例非HNSCC實體瘤中的表達?？傮w而言，YKT6在許多癌癥類型中過度表達。由于樣本量的限制，YKT6在黑色素瘤和膠質母細胞瘤等一些癌癥中沒有發(fā)現(xiàn)差異表達(Figure 8a)。為了研究YKT6的表達與瘤內免疫狀態(tài)的關系，作者分析了YKT6在6種免疫亞型中的表達。此外，在包括肝細胞癌在內的大多數(shù)腫瘤中，YKT6表達上調與低免疫評分、激活的CD8+T細胞水平、激活的B細胞水平、效應記憶CD8+T細胞水平、嗜酸性粒細胞水平、細胞色素T細胞、免疫信號評分、高腫瘤純度、細胞外基質-受體相互作用水平、轉化生長因子-β信號通路水平和EMT_2水平有關(Figure 8b-g）。同時，在包含9,163個腫瘤樣本的獨立TCGA腫瘤隊列中，通過單因素Cox回歸分析，也驗證了YKT6表達對OS和PFS的預后價值。YKT6的表達在幾個獨立的TCGA隊列中被支持作為一個預后生物標志物，其中一些包含高免疫原性、TMB和免疫浸潤的腫瘤，如乳腺癌、肺癌、腎癌、肝癌、尿路上皮癌和宮頸癌 Figure 8h)。最后，檢測YKT6的表達在藥物敏感性中的作用。多種化療藥物的IC50值與YKT6在多水平上顯著相關。YKT6的表達可作為5-氟尿嘧啶和索拉非尼耐藥的生物標志物。
本文小結：
作者的研究還揭示了YKT6與口腔鱗癌細胞體外遷移/侵襲和免疫微環(huán)境重塑密切相關，反映了YKT6在腫瘤發(fā)生和預后中的作用。然而，體內驗證需要在我們未來的研究中解決。此外，應該在體外和體內系統(tǒng)闡明解釋這些觀察結果的更深入的分子機制，以優(yōu)化治療，其中可能包括將YKT6特異性抑制劑與口腔鱗癌患者的ICBS相結合的策略。
