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單細胞技術(shù)在國內(nèi)外成為了熱門科研領(lǐng)域研究的技術(shù)手段新寵。結(jié)合近年來的研究進展，可以看到單細胞測序?qū)τ谀[瘤免疫治療等新手段可以提供巨大幫助。今天給大家分享一篇近日發(fā)表在GenomeBiology（IF:13.583）發(fā)表了應(yīng)用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序全景式刻畫腎透明細胞癌原發(fā)腫瘤和癌栓的腫瘤微環(huán)境差異的研究成果。文章的邏輯思路清晰，很多分析思路值得借鑒。
一、研究背景
在晚期腎細胞癌(RCC)中經(jīng)常發(fā)生伴有瘤栓的血管侵犯。血栓切除術(shù)是最具挑戰(zhàn)性的手術(shù)之一，具有較高的圍手術(shù)期發(fā)病率和死亡率。然而，人們對驅(qū)動瘤栓形成的機制知之甚少。因此亟需提高對腎癌和癌栓的深入認識，解析癌栓發(fā)生發(fā)展機制，為患者提供更加有效的新輔助治療方案。
二、研究思路
三、結(jié)果
1.腫瘤血栓和匹配的腎臟原發(fā)性腫瘤微環(huán)境的 scRNA-seq 分析
為了闡明靜脈瘤栓中的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，研究人員從8名未接受治療的ccRCC患者中收集了19個手術(shù)組織標(biāo)本用于scRNA-seq，包括瘤栓(TT，n=8)、成對的原發(fā)性腫瘤(PT，n=8)和癌旁組織(ART，n=3)(圖2a)。此外，研究人員從140,805個細胞中獲得了大約10億個獨特的轉(zhuǎn)錄本：62,035個細胞來自TT，58,695個細胞來自PT，20,075個細胞來自ART(圖2b)。過濾后，共有約12萬個細胞通過UMAP方法分為9種主要細胞類型：上皮細胞、T細胞、自然殺傷(NK)細胞、骨髓細胞、肌成纖維細胞、內(nèi)皮細胞(EC)、B細胞、漿細胞和肥大細胞(圖2c-f)。
經(jīng)過分析，樣本細胞類型比例直方圖結(jié)果表明ART、PT和TT樣本之間生態(tài)系統(tǒng)組成的顯著異質(zhì)性(圖2g)。
接下來，研究人員將繼續(xù)對關(guān)鍵的細胞亞型，做進一步的聚類和差異表達基因分析。
2. 原發(fā)性腫瘤和腫瘤血栓中 T/NK 細胞的聚集和狀態(tài)分析
由于近期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過免疫檢查點阻斷(ICB)治療后ccRCC患者的瘤栓顯著減少，故研究人員推測腫瘤浸潤性免疫細胞可能在此過程中發(fā)揮重要作用。因此，首先對T和NK細胞進行了無監(jiān)督聚類，并在ART、PT和TT中獲得了12個subcluster(圖3a-d)。為了確定ARTs、PTs和TTs之間的差異，研究人員計算了ARTs、PTs和TTs中每個簇的百分比，發(fā)現(xiàn)PTs中幼稚CD4+T細胞(CD4-C1)的相對百分比低于ART和TT，抑制性Tregs（CD4-C4）的比例更高(圖3e)，表明PTs可能處于更免疫抑制狀態(tài)。對于CD8+T細胞，其與CD4-C1細胞的比例相似。此外，腫瘤組織中耗竭的CD8+T細胞（CD8-C3）的比例增加，但PT和TT之間沒有顯著差異。研究人員從軌跡的通路分析中得出，T細胞活化和淋巴細胞分化在較早階段上調(diào)，細胞周期、ATP代謝和缺氧相關(guān)通路在CD8+T細胞的終態(tài)高度富集。結(jié)果表明，CD8+T細胞在PTs和TTs之間具有相同的過渡軌跡，伴隨著功能失調(diào)和代謝紊亂，最終在PTs和TTs中都被耗竭。
有證據(jù)表明，某些處于祖細胞衰竭狀態(tài)的CD8+T細胞可以增強ICB治療黑色素瘤和腎癌的療效，此外存在部分ccRCC患者使用ICB治療后TT的顯著消退，因此研究人員推測存在一些恢復(fù)的CD8+T細胞亞群可能類似于祖細胞耗竭的表型。研究人員根據(jù)已發(fā)表的研究對CD8+T細胞亞群的祖細胞和最終耗竭的基因特征進行評分。值得注意的是，CD8-C1子簇中的祖細胞耗竭特征顯著富集，并且最終耗竭特征明顯低于其他子集(圖3f)。此外，大多數(shù)祖細胞耗竭的特征基因在TT樣品中的CD8-C1細胞中表達上調(diào)(圖3g)，這進一步證明了祖細胞耗竭的表型富含TT。這些發(fā)現(xiàn)后續(xù)在獨立驗證隊列數(shù)據(jù)中得到了再現(xiàn)(圖3h)。
綜上所述，原發(fā)性ccRCC和瘤栓中組織駐留CD8+T細胞的高特征可能是對ICB治療反應(yīng)良好的暗示。
3. 巨噬細胞在腫瘤血栓中表現(xiàn)出增強的 ECM 重塑活性，在原發(fā)性腫瘤中表現(xiàn)出免疫反應(yīng)性擾動
先天免疫細胞可能是血管內(nèi)TT快速擴展的第一道屏障，這可能對瘤栓形成和對ICB治療的抵抗有重要影響。因此，研究人員分析了PT、TT和ART中16,267個骨髓細胞的轉(zhuǎn)錄組。骨髓細胞表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，分為14個簇(圖4a-c)。與ART相比，PT和TT中的中性粒細胞顯著減少(圖4d)，這意味著PT和TT的腫瘤細胞可能逃脫循環(huán)中性粒細胞的消除。緊接著通過檢查免疫檢查點和免疫相關(guān)的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)除中性粒細胞外，幾乎所有免疫檢查點和逃避相關(guān)的基因都在髓系亞群中高度表達(圖4e)。這些結(jié)果表明，中性粒細胞可能更有效地對抗癌細胞，而其他巨噬細胞、單核細胞和 DC 可能已經(jīng)被 PT 或 TT 腫瘤細胞“教育”。
值得注意的是，本次結(jié)果無法通過已知的標(biāo)記基因清楚地區(qū)分促炎M1和抗炎M2巨噬細胞(圖4f)。有趣的是，研究人員注意到促炎M1表型中的基因表達特征顯著豐富(圖4g)，此外，與TT相比，PT中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）還上調(diào)了免疫檢查點和逃避標(biāo)記的表達(圖4h)。然而，在TT中，研究人員觀察到與腫瘤進展相關(guān)途徑相關(guān)的特征評分增加，包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、細胞外結(jié)構(gòu)組織和血管生成。
總的來說，TAM的復(fù)雜性表明PT和TT之間存在明顯的功能障礙狀態(tài)，PT中具有更強的免疫抑制表型，并且TT中的ECM重塑增強。
4. 原發(fā)性腫瘤和腫瘤血栓中惡性細胞的鑒定和表征
研究人員試圖確定PT和TT之間惡性細胞的鑒定與表征。
首先他們使用肌成纖維細胞和內(nèi)皮細胞作為參考對scRNA-seq數(shù)據(jù)進行InferCNV分析檢測證實了腫瘤細胞。8名患者中有7名在TT和PT之間顯示出相似的CNV模式和亞克隆結(jié)構(gòu)(圖5a-b)。
接下來，研究人員評估了PT和TT之間惡性細胞的轉(zhuǎn)錄差異。通過比較了惡性細胞和近端腎小管細胞的缺氧和血管生成特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PT和TT惡性細胞的缺氧和血管生成特征明顯高于來自ART的細胞。
此外，研究人員針對15,012個PT的惡性上皮細胞和12,078個TT惡性上皮細胞進行聚類(圖5c-e)，對四個簇進行了基因表達差異分析，隨后通過GSVAHallmark進行分析，并觀察了每個簇之間顯著的轉(zhuǎn)錄過程差異(圖5f)。有趣的是，與TAM相似，研究人員觀察到參與干擾素-γ（IFN-γ）反應(yīng)和抗原呈遞途徑的基因富集，與TT相比，PT中免疫檢查點和逃避基因的表達上調(diào)(圖5g-h)。
綜上所述，結(jié)果表明PT中的惡性細胞表現(xiàn)出更強的免疫抑制表型，而TT中的腫瘤細胞表現(xiàn)出更高的ECM重編程狀態(tài)。
5. TT，PT 和 ART 中內(nèi)皮細胞和肌成纖維細胞的詳細表征
為了進一步評估可能促進瘤栓在血管內(nèi)生長和擴展的內(nèi)皮細胞作用，研究人員針對內(nèi)皮細胞(EC)進行了聚類，將這些細胞分為六個不同的簇(圖6a-c)。
此外，研究人員發(fā)現(xiàn)(圖6d-g)：
1）TTs中Endo2的比率高于ARTs和PTs，表明與癌癥相關(guān)的脈管系統(tǒng)形成可能有助于TT在血管內(nèi)空間中的快速延伸，在獨立驗證集合中也觀察到TT中Endo2子集的百分比顯著增加。
2）高水平的Endo2基因特征與TCGAKIRC隊列中的低生存率顯著相關(guān)。
3）與PT的EC中的干擾素反應(yīng)和抗原結(jié)合途徑相關(guān)的表達特征顯著增加，但伴隨著與免疫抑制相關(guān)的基因表達在PT和TT之間的EC子集中的變化。
4）在Endo2亞群中，與TT相比，PT中大多數(shù)與免疫抑制相關(guān)的基因的表達水平上調(diào)，表明PT中的這些細胞可能處于更免疫抑制狀態(tài)。
5）EC在TT中具有增強的ECM重塑和細胞增殖活性。
研究人員進一步研究了ART、PT和TT中的成纖維細胞，通過聚類10,726個肌成纖維細胞發(fā)現(xiàn)了五種不同的亞型(圖6h-j)，結(jié)果表明Myo2可能有助于將腫瘤血管重塑為瘤栓中的成熟表型。
綜上所述，除了TAM和TT中的癌細胞外，TT中的內(nèi)皮細胞可能會修飾ECM以促進瘤栓的生長，而針對具有Endo2特征的細胞的分子療法可能能夠特異性地降低腔靜脈血栓的階段。
6.腫瘤-基質(zhì)相互作用重塑了與存活率低相關(guān)的腫瘤血栓中的細胞外基質(zhì)
首先，鑒于與PT相比，活化的ECM重塑作為TT的巨噬細胞、惡性細胞、EC和肌成纖維細胞的共同趨勢的觀察結(jié)果，研究人員假設(shè)不同的細胞群參與了復(fù)雜的串?dāng)_。為了識別可能的非細胞自主效應(yīng)，研究人員使用CellPhoneDB通過已知的受體-配體對識別不同細胞群之間的假定信號傳導(dǎo)。與ART和PT相比，ECM重塑途徑中多個配體-受體對的相互作用在TT中更強，并且預(yù)測肌成纖維細胞具有與腫瘤細胞和EC顯著相互作用的最強信號，并在獨立驗證集中驗證了這一發(fā)現(xiàn)(圖7a-b)。
接下來，鑒于肌成纖維細胞與惡性細胞和內(nèi)皮細胞之間的強相互作用，研究人員檢查了腫瘤細胞是否控制基質(zhì)肌成纖維細胞的募集。通過將scRNA-seq與bulk RNA-seq進行聯(lián)合分析，結(jié)果表明腫瘤細胞可能通過分泌 ECM 相關(guān)成分在 TT 中募集更多的肌成纖維細胞。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)肌成纖維細胞在 TT 中比在 PT 中增強了 ECs 的募集，這可能潛在地促進血管生成(圖7c-g)。
綜上所述，研究人員發(fā)現(xiàn)瘤栓中更強的腫瘤-基質(zhì)相互作用伴隨著腫瘤細胞和基質(zhì)細胞中一組特定的 ECM 相關(guān)基因和通路的上調(diào)表達。
最后，為了進一步研究腫瘤-基質(zhì)相互作用與患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，研究人員使用顯著的 L-R 對計算腫瘤細胞與肌成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞之間的腫瘤-基質(zhì)相互作用評分，結(jié)果表明，腫瘤-間質(zhì)相互作用與透明腎細胞癌患者生存期降低顯著相關(guān)(圖7h)。
四、討論
在晚期腎細胞癌 (RCC) 中經(jīng)常發(fā)生伴有腫瘤血栓的血管侵犯。腫瘤血栓水平對手術(shù)的復(fù)雜性有重大影響。然而，人們對驅(qū)動腫瘤血栓形成的機制知之甚少。本次研究提出了一個全面的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了原發(fā)性腫瘤和配對腫瘤血栓中腫瘤細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞的異質(zhì)性。研究人員在本次研究中解決了如下問題：
1. 根據(jù)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，進行無差別聚類，重新定義腎臟原發(fā)性腫瘤和腫瘤血栓微環(huán)境中的各種細胞類型。
2. 通過scRNA-seq 揭示了原發(fā)性腫瘤和腫瘤血栓中細胞的異質(zhì)性。
3. 通過scRNA-seq可以了解腎透明細胞癌背后的機制，為進展期腎癌治療和縮減癌栓提供潛在治療通路及靶點。
4. 鑒定細胞自主反應(yīng)和非細胞自主反應(yīng)。
參考文獻
[1] Shi, Y., Zhang, Q., Bi, H. et al. Decoding the multicellular ecosystem of vena caval tumor thrombus in clear cell renal cell carcinoma by single-cell RNA sequencing. Genome Biol 23, 87 (2022). https://doi.org/10.1186/s13059-022-02651-9
