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大家好呀，今天小編給大家?guī)淼囊黄衲甓掳l(fā)表在Frontiers in Endocrinology(IF=6.055)上的一篇文章。題目：“Integrating single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq to construct prognostic signatures to explore the role of glutamine metabolism in breast cance”作者基于谷氨酰胺代謝相關(guān)基因，整合單細(xì)胞及bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后signature。這是一篇很典型的模板分析范文，快來和小編一起學(xué)習(xí)一下吧！
一.研究背景
乳腺癌(breast cancer,BC)是女性發(fā)病率第一的癌癥。近幾十年來，乳腺癌的治療策略已由傳統(tǒng)的根治性乳腺切除術(shù)聯(lián)合放化療向新輔助化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療聯(lián)合手術(shù)等綜合多模式治療轉(zhuǎn)變，但由于患者異質(zhì)性較高，部分患者仍然無法從常規(guī)治療中獲益，生存預(yù)后較差。谷氨酰胺和谷氨酸是非必需氨基酸，是合成氨基酸、脂類和核酸所需氮和碳的主要來源，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的代謝過程很重要。侵襲性癌癥，如三陰性乳腺癌(TNBC)，其惡性表型特征之一是谷氨酰胺的代謝。利用谷氨酰胺代謝相關(guān)基因預(yù)測(cè)治療療效和臨床預(yù)后值得進(jìn)一步研究。因此，本篇文章基于谷氨酰胺代謝相關(guān)基因(GRGs)，通過分析乳腺癌單細(xì)胞RNA-seq及bulk RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)谷氨酰胺代謝的預(yù)后signature，以期為BC的診斷和治療提供新的視角。
二.主要結(jié)果
1.BC單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析
圖一展示了本研究的流程圖。通過質(zhì)量控制，降維聚類分群等單細(xì)胞數(shù)據(jù)處理操作后，10個(gè)樣本的細(xì)胞共分為18個(gè)簇(圖2A、B)?；谝阎募?xì)胞marker基因表達(dá)，將細(xì)胞注釋為8種細(xì)胞類型，如內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞(圖2C、D)。接下來，作者通過R包AUCell計(jì)算了各細(xì)胞類型的GRGs活性打分，探討GRGs的表達(dá)特征(圖2E)。作者根據(jù)GRGs的AUC評(píng)分中位數(shù)將其分為高-谷氨酰胺AUC組和低-谷氨酰胺AUC組，結(jié)果表明，AUC值主要在巨噬細(xì)胞中較高(圖2F)。
2.加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析與構(gòu)建
在這一部分，作者通過WGCNA分析尋找與谷氨酰胺共變的基因集。如圖3A所示，選擇軟閾值為6進(jìn)行后續(xù)的分析；將相似度低于0.25的模塊合并，最終生成12個(gè)非灰度模塊(圖3B、C)，作者發(fā)現(xiàn)，綠色和紫色模塊(每個(gè)模塊包含2,783個(gè)基因)與谷胱氨酸基因的關(guān)系最密切。為了進(jìn)一步探索GRGs與BC患者預(yù)后的關(guān)系，作者將單細(xì)胞和Bulk-RNA分析中獲得的影響谷氨酰胺代謝活性的最相關(guān)基因取交集，最終219個(gè)基因用于后續(xù)分析(圖3D)。接下來作者在TCGA-BC的訓(xùn)練集上使用單因素回歸分析確定預(yù)后基因；LASSO-Cox回歸和多因素回歸分析用于建立預(yù)后模型(圖3E)。最終的預(yù)后模型包含21個(gè)基因，其中8個(gè)是危險(xiǎn)因素，13個(gè)是保護(hù)因素(圖3F)。
3.谷氨酰胺相關(guān)預(yù)后模型的驗(yàn)證和nomogram的構(gòu)建
為了證明谷氨酰胺相關(guān)預(yù)后模型的可信度，作者進(jìn)行了生存分析。結(jié)果表明，在訓(xùn)練、測(cè)試和所有隊(duì)列的患者中，高危組患者的總生存率較低危組更低(圖4A-C)；在外部驗(yàn)證集的GEO隊(duì)列中也獲得了相同的結(jié)果(圖4D)。作者在訓(xùn)練隊(duì)列和試驗(yàn)隊(duì)列中進(jìn)行ROC曲線分析，以進(jìn)一步研究谷氨酰胺相關(guān)預(yù)后模型在評(píng)估BC患者預(yù)后中的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，谷氨酰胺相關(guān)預(yù)后模型具有良好的預(yù)測(cè)效能(圖4E-H)。
接下來作者利用臨床信息和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分建立nomogram圖(圖4I)，校準(zhǔn)曲線驗(yàn)證了nomogram圖與作者的預(yù)測(cè)具有較好的一致性，與實(shí)際結(jié)果具有較好的一致性(圖4J)。作者還進(jìn)行了決策曲線和一致性指數(shù)研究，表明該nomogram在預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面是有效的(圖4K、L)。通過ROC曲線進(jìn)一步評(píng)估nomogram的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明其準(zhǔn)確性良好(圖5A-C)。
4.突變景觀分析
在這一部分，作者著重研究了高危組和低危組代表性基因的突變情況(圖5D)。TP53、KMT2C、HMCN1、USH2A、DMD等基因在高危組中突變率居前五位。低危組突變率最高的前5位基因分別為PIK3CA、CDH1、MAP3K1、PTEN和GATA3。腫瘤突變負(fù)荷(Tumor mutation load, TMB)在兩組間有顯著性差異，高危組突變負(fù)荷高于低危組(圖5E)。進(jìn)一步分析顯示，隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加，腫瘤突變負(fù)荷也相應(yīng)增加，兩者呈正相關(guān)(圖5F)。對(duì)患者進(jìn)行亞組分析后發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)得分/高TMB組患者的生存預(yù)后較差(圖5G、H)。
5.生物學(xué)功能和通路分析
在這一部分，作者主要探討B(tài)C高危組患者預(yù)后不良的潛在機(jī)制。基因集變異分析(GSVA)結(jié)果顯示，高危組中富集的hallmark包括糖酵解、Myc Targets V1、G2M檢查點(diǎn)和E2F靶點(diǎn);低危組富集特征包括炎癥反應(yīng)、IL6 jak stat3信號(hào)和干擾素γ反應(yīng)等(圖6A)。
高危樣本可能通過上調(diào)糖酵解途徑而導(dǎo)致BC患者預(yù)后變差；有研究表明高M(jìn)YC靶點(diǎn)v1和v2評(píng)分與ER陽性BC中促癌和抗癌免疫細(xì)胞浸潤增加有關(guān)。這些通路在BC高危組中更為普遍，可能在控制腫瘤發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。為了探索高危組和低危組樣本的TME，作者使用ssGSEA來評(píng)估兩個(gè)危險(xiǎn)組之間的免疫細(xì)胞組成，如圖6B、C顯示，在高危組患者的腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞浸潤程度普遍低于低危組。
6.免疫景觀與免疫治療
為了進(jìn)一步了解TCGA-BC隊(duì)列中22種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(TICs)的相對(duì)含量的分布和相關(guān)性，作者使用CIBERSORT方法測(cè)量了每個(gè)樣本中的免疫細(xì)胞浸潤水平。作者發(fā)現(xiàn)低危組的免疫細(xì)胞浸潤總體高于高危組。NK細(xì)胞和T細(xì)胞CD4+在高危組浸潤更多(圖7A)。通過使用R包ESTIMATE，低危組的基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分較高，表明該組的TME總體免疫水平和免疫原性較高。作者還分析了腫瘤純度，結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)(圖7B、C)。
接下來作者還進(jìn)行了免疫檢查點(diǎn)分析和免疫治療反應(yīng)評(píng)估，氣泡圖顯示了模型基因和46個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因之間的相關(guān)性(圖8A)，在高危組中僅觀察到1個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因ICOSLG的表達(dá)(圖8B)。作者發(fā)現(xiàn)，低危亞型的免疫表型得分(IPS)和檢查點(diǎn)阻斷評(píng)分高于高危亞型，突顯出低?；颊呖赡芨m合接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICI)治療，并獲得更顯著的獲益(圖8C)。作者還進(jìn)行了腫瘤免疫功能障礙和排除(tumor immune dysfunction and exclusion, TIDE)分析，結(jié)果表明高危組TIDE評(píng)分較低，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與TIDE呈負(fù)相關(guān)(圖8D)。
7.SNX3在BC樣品中的表達(dá)
TCGA數(shù)據(jù)中SNX3的生存預(yù)后分析顯示，SNX3高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差(圖9A)，且SNX3在BC組織中有較高的表達(dá)水平(圖9B)，圖9C顯示了NX3的GO富集分析柱狀圖。作者在其自己的臨床組織樣本中發(fā)現(xiàn)了相同的表達(dá)趨勢(shì)(圖9D)。通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，圖9E顯示轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中SNX3的表達(dá)明顯降低(圖9E)。
接下來作者對(duì)SNX3基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。敲低SNX3后，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞株的集落形成能力顯著降低(圖10A)。在5-乙基-2脫氧尿苷(EdU)測(cè)定中，敲除SNX3，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系的增殖能力顯著降低，提示SNX3可能促進(jìn)增殖(圖10B)。圖10C,D中的Healing和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，SNX3敲低后，細(xì)胞遷移和侵襲比紊亂的siRNA慢，表明敲低SNX3可能會(huì)減弱MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞株的遷移和侵襲。
至此，這篇文章就介紹完啦。總結(jié)一下，作者首先在單細(xì)胞和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)中分析了谷胱氨酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，其次通過WGCNA分析得到了與谷胱氨酸代謝最相關(guān)的基因模塊，并通過這些基因構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后打分模型。接下來就是大家常見的分組比較各種差異了，最后對(duì)SNX3這個(gè)預(yù)后基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)對(duì)其敲低降低了腫瘤細(xì)胞的集群和遷移侵襲能力。縱觀全文，沒有一個(gè)大家不會(huì)的生信方法，生信套路分析+簡單實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證永遠(yuǎn)是發(fā)文的利器！
