肺癌的生存率低和預(yù)后差已廣為所知，作為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都非常高的一種癌癥，其單細(xì)胞方向的研究也非常廣泛了。今天給大家介紹的這篇肺腺癌的單細(xì)胞文章[Oncogene：9.867]，為我們提供了一個(gè)新的思路。
Single-cell RNA sequencing reveals distinct tumor microenvironmental patterns in lung adenocarcinoma
一、數(shù)據(jù)和代碼：
數(shù)據(jù)：
代碼：
【這篇文章給的代碼十分清晰，尤其是單細(xì)胞數(shù)據(jù)的前期處理和細(xì)胞注釋?zhuān)灰约拔恼轮忻總€(gè)結(jié)果和圖，包括作者的數(shù)據(jù)和代碼結(jié)構(gòu)，大家都可以借鑒學(xué)習(xí)】
作者代碼和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)
二、背景：
肺癌預(yù)后差，占全世界癌癥新發(fā)病例和死亡人數(shù)的大多數(shù)。肺癌最常見(jiàn)的亞型，尤其是不吸煙者，是肺腺癌。在本研究中，作者通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析了肺腺癌腫瘤微環(huán)境中的腫瘤上皮細(xì)胞和相關(guān)非惡性細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)患者腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)細(xì)胞組成遵循與癌細(xì)胞分化等級(jí)相關(guān)的特定模式。將我們的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)以bulk基因表達(dá)為特征的回顧性隊(duì)列，揭示了微環(huán)境模式的潛在預(yù)后相關(guān)性。作者的結(jié)論是，對(duì)肺腺癌微環(huán)境的全面分析可能有助于揭示基于癌細(xì)胞和微環(huán)境特征的新的臨床相關(guān)腫瘤亞型。
三、內(nèi)容和結(jié)果：
(一)單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示肺腺癌細(xì)胞多樣性
- 為了研究肺腺癌的細(xì)胞組成，收集10份正常肺組織和10份肺腺癌組織樣本，并對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，在質(zhì)量控制和篩選后產(chǎn)生114489個(gè)高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Fig. 1A)。
- 通過(guò)UMAP進(jìn)行分析和可視化顯示，不同組織類(lèi)型或患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組混合在許多簇中，去除批次效應(yīng)后，部分形成腫瘤或患者特異性簇，表明潛在的生物學(xué)差異(Fig. 1B,C)。
- 為了揭示哪些細(xì)胞最能解釋患者間的異質(zhì)性，作者分析了上皮、免疫和基質(zhì)細(xì)胞marker基因表達(dá)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組?？偣哺采w了20450個(gè)上皮細(xì)胞、89766個(gè)免疫細(xì)胞和4273個(gè)基質(zhì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。
- 上皮轉(zhuǎn)錄組的產(chǎn)量因組織學(xué)亞型而異，因?yàn)槲覀冇^察到實(shí)體/肉瘤樣癌的頻率<10%，而鱗狀細(xì)胞癌/腺泡癌的頻率高達(dá)>40%。上皮細(xì)胞表現(xiàn)出最高程度的患者間異質(zhì)性(Fig. 1D)。
Fig.1Single-cell RNA sequencing of lung adenocarcinomas
（二）腫瘤上皮細(xì)胞的瘤間異質(zhì)性反映了分化梯度
- 為了進(jìn)一步分析上皮細(xì)胞中患者間的異質(zhì)性，對(duì)上皮轉(zhuǎn)錄組重新聚類(lèi)。基于組織起源，Cluster被定義為正?；蚰[瘤，其與細(xì)胞的拷貝數(shù)狀態(tài)基本一致，并證明腫瘤純度>90%。
- 基于典型基因marker和基因Signatures，注釋細(xì)胞類(lèi)型。腫瘤細(xì)胞cluster與正常細(xì)胞細(xì)胞cluster分離，腫瘤細(xì)胞主要是患者特異性的，表明腫瘤間異質(zhì)性(Fig. 2A,B)。
- 腫瘤上皮細(xì)胞中的差異表達(dá)基因按患者分組，每個(gè)患者最多顯示前十個(gè)基因(Fig. 2C)。不同患者免疫染色表明EGFR、TFF3、CDKN2A和SFTPA2與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)(Fig. 2D)。
- 按患者分組的腫瘤上皮細(xì)胞平均通路活性得分(Fig. 2E)。
- 盡管存在明顯的腫瘤間異質(zhì)性，作者注意到上皮腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在患者亞組中的共同特征。為了強(qiáng)調(diào)腫瘤之間的相似性，上皮轉(zhuǎn)錄組被嵌入低維UMAP中。基于所有腫瘤上皮單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的主成分分析；沿著PC1的腫瘤細(xì)胞特征模塊分?jǐn)?shù)示意圖(Fig. 2F、G、H)。
Fig.2 肺腺癌中腫瘤上皮細(xì)胞的瘤間異質(zhì)性
(三)、肌成纖維細(xì)胞的兩種亞型構(gòu)成了腫瘤基質(zhì)微環(huán)境
- 第三部分主要介紹肺腺癌間質(zhì)微環(huán)境的組成，作者首先正常和腫瘤組織樣本中的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分類(lèi)和分析,根據(jù)不同marker的表達(dá)主要分為內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和間皮細(xì)胞(Fig.3A、B)。
- 檢測(cè)到腫瘤組織中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞簇的轉(zhuǎn)移，并且在一個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中也觀察到了這一點(diǎn)。
- 值得注意的是，肌成纖維細(xì)胞簇2幾乎只存在于腫瘤組織中，而肌成纖維細(xì)胞簇1包含正常組織和腫瘤組織。通過(guò)對(duì)間質(zhì)微環(huán)境中不同細(xì)胞類(lèi)型差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞簇2高表達(dá)COL3A1、COL5A1等基因，表明其在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起作用(Fig.3C)。
- 同時(shí)，通過(guò)計(jì)算不同細(xì)胞類(lèi)型信號(hào)通路活性，發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞簇2表現(xiàn)TGFβ和JAK/STAT信號(hào)的高活性以及缺氧誘導(dǎo)相關(guān)通路（Fig.3D）。而兩個(gè)cluster的相關(guān)性分析(Fig.3E)、免疫染色(Fig.3F)驗(yàn)證肌成纖維細(xì)胞簇1和簇2分別代表肌成纖維細(xì)胞的“正常樣”和“癌癥相關(guān)”表型，并且它們中的任何一個(gè)都可以主導(dǎo)基質(zhì)微環(huán)境。
Fig.3 肺腺癌間質(zhì)微環(huán)境的組成
（四）腫瘤免疫微環(huán)境表現(xiàn)出促炎和非炎癥特性
- 第四部分作者對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行了分類(lèi)和分析，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫微環(huán)境的細(xì)胞組成發(fā)生了顯著的定量變化(Fig.4AB)。
- 然后分析不同巨噬細(xì)胞cluster的炎癥和M1/M2極化相關(guān)的模塊得分，發(fā)現(xiàn)cluster 2表達(dá)高水平的促炎性趨化因子，如CXCL9和CXCL10、促炎性細(xì)胞因子IL1B，以及與免疫反應(yīng)和M1極化相關(guān)的基因特征(Fig.4C)。
- 通過(guò)在患者內(nèi)的促炎癥和非炎癥的相關(guān)性分析，確定巨噬細(xì)胞cluster 1和2分別代表非炎癥和促炎癥功能(Fig.4D)。
- 通過(guò)CXCL9和CD123免疫染色驗(yàn)證促炎性單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞cluster 2和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞的分布(Fig.4E)
- 分析CD8+T細(xì)胞不同cluster的耗竭得分和毒性得分(Fig.4F)。確定耗竭型的CD8+T細(xì)胞與促炎性單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量顯著相關(guān)（圖4G）。
綜上所述，作者確定了從正常肺組織到腺癌患者免疫細(xì)胞成分的總體變化，以及導(dǎo)致患者間異質(zhì)性的不同腫瘤免疫微環(huán)境模式。
Fig .4 肺腺癌免疫微環(huán)境的組成
(五)、肺腺癌的腫瘤微環(huán)境主要有兩種類(lèi)型
- 為了分析腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞普遍性，計(jì)算患者骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞/肌肉細(xì)胞的細(xì)胞比例。
- 基于基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞簇的比例，利用主成分分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤根據(jù)腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞組成形成亞群(Fig.5A)。
- 基于腫瘤微環(huán)境的組成，將患者分為不同的亞組——兩種不同的模式(Fig.5B)，分析基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞cluster細(xì)胞比例的相關(guān)性(Fig.5C)。
- 量化兩種模式的受體-配體互作(Fig.5D)。為了測(cè)試腫瘤微環(huán)境模式是否可以通過(guò)患者隊(duì)列中的bulk基因表達(dá)模式來(lái)重現(xiàn)，分析TCGA中533名肺腺癌患者的marker基因的表達(dá)。
- 研究這些患者亞組的生物學(xué)和臨床相關(guān)性，分析TCGA肺腺癌隊(duì)列中不同基因特征表達(dá)的總體生存率。與CP2E模式的特征相比，N3MC相關(guān)基因特征與更好的總體存活率相關(guān)。
Fig.5 肺腺癌的腫瘤微環(huán)境模式 四、結(jié)論：
我們來(lái)總結(jié)一下這篇文章的整體思路，在拿到肺腺癌的單細(xì)胞數(shù)據(jù)后，正常組織細(xì)胞類(lèi)型和腫瘤微環(huán)境中主要細(xì)胞類(lèi)型——上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞；最后根據(jù)腫瘤微環(huán)境組成，將患者劃分為兩種模式，并在大規(guī)模的bulk數(shù)據(jù)中得到了驗(yàn)證。
文章的思路非常簡(jiǎn)單，其精彩的點(diǎn)除了最終根據(jù)微環(huán)境的組織發(fā)現(xiàn)患者可以分為兩種模式外；前期的研究非常細(xì)致，一點(diǎn)點(diǎn)的解析不同的細(xì)胞類(lèi)型。這樣看來(lái)，這篇文章確實(shí)很值得學(xué)習(xí)和借鑒，雖然大家對(duì)常規(guī)的單細(xì)胞流程都比較熟悉了如經(jīng)過(guò)常規(guī)的處理和過(guò)濾，但是這篇文章的規(guī)范化，值得一覽。
最后給大家一個(gè)干貨，作者用來(lái)注釋細(xì)胞類(lèi)型的marker。對(duì)細(xì)胞類(lèi)型marker沒(méi)有總結(jié)和記錄的崽崽們，拿走不謝。其他腫瘤或細(xì)胞類(lèi)型的marker，大家可以參考相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。
筆記：
識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型
獲得細(xì)胞類(lèi)型已知的marker【從文章或者cellMarker、ImmGen數(shù)據(jù)庫(kù)】
通過(guò)前期處理后，將細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)，識(shí)別cluster特異的基因【“Seurat v3 】
對(duì)cluster賦予相應(yīng)的細(xì)胞類(lèi)型【根據(jù)marker的表達(dá)情況，如果cluster特異高表達(dá)某類(lèi)細(xì)胞marker(log2 FC值和FDR_p值在top5或top10以?xún)?nèi)的差異基因)】
正常細(xì)胞類(lèi)型，一般其marker比較固定，即通過(guò)某些marker基因/蛋白的組合就能唯一確定該細(xì)胞類(lèi)型。
有些細(xì)胞類(lèi)型，可以分成多種更為特異的細(xì)胞類(lèi)型，如文章中對(duì)免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的分類(lèi)等。
肺腺癌細(xì)胞注釋marker參考文獻(xiàn)：
Single-cell RNA sequencing reveals distinct tumor microenvironmental patterns in lung adenocarcinoma [published online ahead of print, 2021 Oct 18]. Oncogene.
