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大家好呀，今天分享的文章題為動(dòng)態(tài)scRNA-seq分析揭示多發(fā)性骨髓瘤中與微環(huán)境重塑和藥物敏感性相關(guān)的特異的腫瘤進(jìn)程，于今年一月發(fā)表在《Cell & Bioscience》（IF = 9.584）上，文章有許多創(chuàng)新之處，讓我們一起學(xué)習(xí)一下吧！
一、摘要
多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma（MM））是一種以惡性漿細(xì)胞克隆性增殖為特征的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。 盡管進(jìn)行了廣泛的研究，但MM中驅(qū)動(dòng)藥物敏感性和臨床結(jié)局的分子機(jī)制仍然難以捉摸。目前，使用蛋白酶體抑制劑（proteasome inhibitors（PIs））、免疫調(diào)節(jié)藥物（immunomodulatory drugs（IMiDs））和單克隆抗體等治療可有效緩解新診斷的MM（newly diagnosed MM，NDMM）的疾病嚴(yán)重程度并延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。本篇文章采用scRNA-seq技術(shù)研究了MM個(gè)體在硼替佐米-環(huán)磷酰胺-地塞米松（VCD）治療前后的腫瘤異質(zhì)性和分子動(dòng)力學(xué)。發(fā)現(xiàn)在2個(gè)周期的VCD治療后，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）和代謝相關(guān)程序減少，而應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)和免疫反應(yīng)程序增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)程序的低表達(dá)與MM中不利的藥物應(yīng)答和低生存率相關(guān)，這可能是由于MHC I類(lèi)介導(dǎo)的抗原呈遞和免疫監(jiān)視的標(biāo)記物下調(diào)以及與免疫逃逸相關(guān)的標(biāo)記物的上調(diào)導(dǎo)致的。此外，結(jié)合免疫細(xì)胞譜分析，作者揭示了腫瘤內(nèi)在免疫反應(yīng)程序與微環(huán)境中免疫抑制表型之間的聯(lián)系（其證據(jù)是T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞的耗竭狀態(tài)以及檢查點(diǎn)分子和抑制基因的表達(dá)）。值得注意的是，YBX1的表達(dá)與骨髓瘤中免疫激活信號(hào)的下調(diào)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的減少相關(guān)，從而導(dǎo)致不良預(yù)后。
二、結(jié)果
1、MM患者vs健康對(duì)照的單細(xì)胞表達(dá)圖譜和細(xì)胞分型
使用10× Genomics對(duì)10名MM患者和3名健康對(duì)照的骨髓（Bone Marrow（BM））和外周血（PB）進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析。MM患者采用VCD方案治療，并在治療后2個(gè)周期收集配對(duì)樣本。共收集22份PBMC和22份骨髓單核細(xì)胞（BMMC）并進(jìn)行scRNA-seq分析。去批次效應(yīng)和質(zhì)量篩選后共獲得241440個(gè)高質(zhì)量單核細(xì)胞，并根據(jù)標(biāo)記基因鑒定了13種主要細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)UMAP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞和漿/骨髓瘤細(xì)胞明顯分離，根據(jù)漿細(xì)胞的標(biāo)記基因進(jìn)行打分，漿/骨髓瘤細(xì)胞的得分更高。隨后，作者分析了25231個(gè)漿細(xì)胞和216209個(gè)免疫細(xì)胞，并對(duì)MM中的腫瘤和免疫細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行了綜合分析。結(jié)果表明：一些前體細(xì)胞在BM中富集，而其他主要的免疫細(xì)胞都在PB中富集。還發(fā)現(xiàn)在接受VCD治療的患者中，除了漿細(xì)胞外，B細(xì)胞的比例也降低了（基于免疫調(diào)節(jié)藥物的治療后的MM患者中發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果）（圖1：A-C）。
2、MM中腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的識(shí)別
為了比較正常漿細(xì)胞（nPCs）和骨髓瘤細(xì)胞，本文將PC重新劃分為20個(gè)不同的簇，結(jié)果顯示MM患者之間存在很強(qiáng)的異質(zhì)性，而來(lái)自健康對(duì)照的nPCs和少量MM細(xì)胞聚類(lèi)在一起（cluster15），表明MM樣本中存在nPCs。因此，作者通過(guò)CNV來(lái)區(qū)分骨髓瘤細(xì)胞和nPCs，使用來(lái)自健康對(duì)照的nPCs作為參考，估計(jì)了拷貝數(shù)的改變（CNAs），通過(guò)這種方式很好的區(qū)分了骨髓瘤細(xì)胞和nPCs。骨髓瘤細(xì)胞高度表達(dá)眾所周知的驅(qū)動(dòng)基因，包括CCND1、NDS2/MMSET、CCND3，通路分析顯示，骨髓瘤細(xì)胞中多種生物學(xué)過(guò)程和通路顯著上調(diào)，隨后基于基因表達(dá)的層次聚類(lèi)將骨髓瘤細(xì)胞分類(lèi)為與其細(xì)胞遺傳學(xué)一致的轉(zhuǎn)錄亞型。這些結(jié)果表明，骨髓瘤間的異質(zhì)性可以通過(guò)眾所周知的致癌驅(qū)動(dòng)基因和不同的轉(zhuǎn)錄特征來(lái)解釋?zhuān)▓D1：D-E）。
為了進(jìn)一步研究腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH），分別對(duì)每個(gè)MM患者的PCs進(jìn)行聚類(lèi)分析，并結(jié)合它們的CNA來(lái)檢測(cè)總體ITH。CNA數(shù)量與細(xì)胞簇?cái)?shù)量沒(méi)有明顯的相關(guān)性。接下來(lái)，作者通過(guò)每個(gè)MM患者的基因表達(dá)譜定義患者腫瘤細(xì)胞的ITH評(píng)分，發(fā)現(xiàn)每個(gè)患者的ITH評(píng)分明顯不同。然而，平均ITH評(píng)分與聚類(lèi)數(shù)或CNA均沒(méi)有顯著的相關(guān)性。用更大的數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)MM的ITH評(píng)分明顯高于新診斷的患者（NDMM）。生存分析顯示，較高的ITH評(píng)分與較差的總生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）相關(guān)?？傊?，ITH可以預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。
3、四種惡性細(xì)胞程序在治療后發(fā)生失調(diào)
藥物誘導(dǎo)的變化可能揭示化療藥物作用的分子機(jī)制，通過(guò)研究VCD治療前后骨髓瘤細(xì)胞的整體基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)每個(gè)患者都表現(xiàn)出不同程度的腫瘤細(xì)胞豐度減少。ITH評(píng)分在治療后也顯示出明顯的減少，可能是由于腫瘤細(xì)胞的消除。比較每個(gè)病人驅(qū)動(dòng)基因，發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)減少與藥物反應(yīng)之間存在潛在聯(lián)系。由于腫瘤間存在異質(zhì)性，本文分別測(cè)定了同一受試者中每個(gè)治療前和治療后的腫瘤細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集分析，并確定了化療后MM患者共享的4個(gè)功能模塊，包括UPR、代謝相關(guān)、應(yīng)激相關(guān)和免疫反應(yīng)。UPR和代謝的表達(dá)在處理后的樣本中持續(xù)減少。應(yīng)激反應(yīng)得分在治療后顯著上升，表明化療引起腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，反過(guò)來(lái)可能有助于骨髓瘤抗凋亡和從藥物靶向中恢復(fù)從而導(dǎo)致抗藥；免疫反應(yīng)激活途徑相關(guān)的各種基因治療后上調(diào)，表明治療誘導(dǎo)的抗骨髓瘤免疫反應(yīng)是由多種途徑激活介導(dǎo)的。通過(guò)對(duì)腫瘤特異型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析，發(fā)現(xiàn)了與治療相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（TFs），例如，XBP1和STAT3的調(diào)控活性降低，而治療后的UPR和IL6-STAT3信號(hào)通路降低。相反，F(xiàn)OSB、MYC及其翻譯調(diào)控因子YBX1在治療后調(diào)控活性增加。其他與表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的活性上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子（EZH2、SMARCA4和SETDB1）表明在治療過(guò)程中存在染色體重塑（圖2）。
4、低免疫反應(yīng)程序預(yù)測(cè)MM的不良藥物反應(yīng)和預(yù)后
為了研究治療后應(yīng)激和免疫反應(yīng)程序的增加是否在大隊(duì)列中的疾病進(jìn)展和治療耐藥性中發(fā)揮作用，本文對(duì)大量的MM樣本隊(duì)列進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激對(duì)患者預(yù)后的影響有限，因此作者關(guān)注的是免疫反應(yīng)特征。通過(guò)對(duì)本研究中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分，發(fā)現(xiàn)硼替佐米標(biāo)準(zhǔn)患者的免疫反應(yīng)評(píng)分比良好的患者明顯降低，這表明低免疫反應(yīng)可能會(huì)影響藥物敏感性。然后本文進(jìn)一步測(cè)試了這一特征是否能影響患者的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)低免疫反應(yīng)評(píng)分與更差的OS和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）顯著相關(guān)。這些結(jié)果共同表明，免疫反應(yīng)程序與不良的藥物反應(yīng)有關(guān)，從而導(dǎo)致腫瘤具有低水平的這種細(xì)胞狀態(tài)的患者預(yù)后較差（圖3）。
5、免疫反應(yīng)較低的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出免疫逃逸表型
在觀察了免疫反應(yīng)對(duì)MM臨床結(jié)果的影響后，又探索了具有離散免疫反應(yīng)評(píng)分的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，并確定了它們可能導(dǎo)致不良預(yù)后的差異。初步測(cè)定了每個(gè)患者的腫瘤細(xì)胞中免疫反應(yīng)基因的表達(dá)評(píng)分，并根據(jù)評(píng)分將患者分成了高低兩組。然后對(duì)兩組進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)評(píng)分低的腫瘤多種免疫反應(yīng)通路下調(diào)，包括TNFα和IFN信號(hào)通路；而與細(xì)胞分裂、MYC信號(hào)通路和代謝過(guò)程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)表達(dá)上調(diào)，為了進(jìn)一步證實(shí)這種“免疫排斥”表型，又檢測(cè)了調(diào)節(jié)免疫監(jiān)視的基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MHC I類(lèi)分子的表達(dá)顯著降低，從而導(dǎo)致低免疫反應(yīng)性腫瘤中的免疫監(jiān)視受損。本文還檢測(cè)了免疫抑制基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在低免疫應(yīng)答骨髓瘤中免疫逃逸評(píng)分增加（CD47、LGALS1和TGFB1高表達(dá)）。這些結(jié)果表明，這些腫瘤具有活躍的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，以及逃避免疫補(bǔ)救細(xì)胞死亡的高能力（圖4）。
6、腫瘤微環(huán)境中功能失調(diào)的免疫細(xì)胞的特征分析
本文探討了治療前后主要免疫細(xì)胞群體的變化，對(duì)每種細(xì)胞類(lèi)型治療前后的DEGs進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)免疫細(xì)胞中IFN應(yīng)答基因、應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)以及相關(guān)通路下調(diào)；然而組蛋白相關(guān)基因在治療后免疫細(xì)胞中上調(diào)；T細(xì)胞中的細(xì)胞毒性標(biāo)志物，以及骨髓亞群中的促炎基因在治療后表達(dá)上調(diào)。本文提取了MM中T細(xì)胞簇并劃分成11個(gè)亞群，與高免疫應(yīng)答腫瘤相比，CD8效應(yīng)T細(xì)胞和IFN應(yīng)答T細(xì)胞與NK細(xì)胞一起表現(xiàn)出明顯的衰竭。此外，單核細(xì)胞在這些患者中也顯示出免疫檢查點(diǎn)和逃逸基因的表達(dá)增加。為了驗(yàn)證腫瘤內(nèi)在免疫反應(yīng)信號(hào)與T/NK細(xì)胞功能之間的關(guān)系，作者從這些患者（GSE161801）中有配對(duì)免疫細(xì)胞的多發(fā)性骨髓瘤（RRMM）患者中提取了骨髓瘤細(xì)胞，并分析了本研究數(shù)據(jù)集中識(shí)別的特征。結(jié)果顯示，骨髓瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)激活特征與CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（T_CD8_tox）的共刺激評(píng)分、NKdim、CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞和γδT（gdT）細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)分呈正相關(guān)；相反，腫瘤細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤中免疫激活的早期減少持續(xù)到復(fù)發(fā)階段，而CD8+效應(yīng)T、NK和γδT細(xì)胞在免疫排斥腫瘤微環(huán)境（TME）中的功能受損有助于骨髓瘤細(xì)胞的免疫逃逸（圖5）。
7、YBX1參與了MM的免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和臨床結(jié)果
鑒定了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子YBX1（Y-box結(jié)合蛋白-1，YB-1），該TF在低免疫反應(yīng)狀態(tài)的骨髓瘤細(xì)胞中上調(diào)，與MHC I類(lèi)分子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與免疫抑制基因LGALS1和TGFB1的表達(dá)呈正相關(guān)，這些都表明YBX1可能是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)程序的一個(gè)潛在因素。與非常好的部分緩解（VGPR/PR）患者相比，穩(wěn)定疾病（SD）患者在基線和2個(gè)治療周期中的腫瘤中均有YBX1表達(dá)上調(diào)。分析來(lái)自GSE161195數(shù)據(jù)集中原發(fā)性難治性MM（PRMM）的患者，驗(yàn)證了YBX1高表達(dá)與低藥物反應(yīng)之間的相關(guān)性。生存分析結(jié)果顯示YBX1的高表達(dá)顯著預(yù)示了MM患者較差的OS和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）。同樣，對(duì)CoMMpass隊(duì)列進(jìn)行了GSEA分析結(jié)果顯示，與低YBX1組相比，MM高表達(dá)YBX1組的造血干細(xì)胞分化、mTORC1信號(hào)通路、MYC靶點(diǎn)、細(xì)胞周期等多種生物學(xué)過(guò)程均上調(diào)。相比之下，YBX1高表達(dá)組中涉及免疫應(yīng)答激活的通路被下調(diào)。通過(guò)對(duì)CoMMpass隊(duì)列進(jìn)行ssGSEA分析發(fā)現(xiàn)，與YBX1高表達(dá)的患者相比，CD4+/CD8+記憶T細(xì)胞，γδT，NK，多個(gè)髓系亞群和B細(xì)胞在YBX1低表達(dá)的患者中明顯降低。
為了驗(yàn)證本研究中scRNA-seq數(shù)據(jù)中關(guān)于YBX1在MM中的功能的結(jié)果，作者進(jìn)一步對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞系（HMCLs）和原發(fā)性骨髓瘤樣本進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。敲除YBX1后，U266、OPM2和RPMI-8226的細(xì)胞增殖顯著下降。同樣，在抑制YBX1后，原發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力下降。通過(guò)體外共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)了降低YBX1的表達(dá)使T細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞相互總用增強(qiáng)。這些結(jié)果重現(xiàn)并驗(yàn)證了本研究在scRNA-seq分析中觀察到的基因表達(dá)模式，并表明YBX1通過(guò)去除T細(xì)胞功能和促進(jìn)免疫抑制來(lái)促進(jìn)其對(duì)骨髓瘤生存和藥物反應(yīng)的影響（圖6）。
三、小結(jié)
本研究使用scRNA-seq揭示了MM的異質(zhì)性惡性腫瘤和微環(huán)境變化，并基于治療前和治療后的動(dòng)態(tài)分析識(shí)別了特異性轉(zhuǎn)錄組，MM在治療過(guò)程中的分子和細(xì)胞復(fù)雜性，并為藥物反應(yīng)和治療選擇提供了潛在的分子生物標(biāo)志物。本研究有4個(gè)亮點(diǎn)：1、作者對(duì)患者治療前和治療后的樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序研究，很好地比較了每個(gè)細(xì)胞簇治療前后差異基因的功能特征。2、當(dāng)作者發(fā)現(xiàn)MM和漿細(xì)胞高度相關(guān)時(shí)，通過(guò)對(duì)漿細(xì)胞簇的重新聚類(lèi)以及使用CNA區(qū)分患者中正常的漿細(xì)胞和非正常漿細(xì)胞。3、應(yīng)用免疫評(píng)分量化免疫微環(huán)境并確定了低免疫評(píng)分和免疫逃逸相關(guān)。4、最后，作者通過(guò)體外培養(yǎng)確定了YBX1通過(guò)去除T細(xì)胞功能和促進(jìn)免疫抑制來(lái)促進(jìn)其對(duì)骨髓瘤生存和藥物反應(yīng)的影響。
參考文獻(xiàn)：Chen M, Wan Y, Li X, Xiang J, Chen X, Jiang J, Han X, Zhong L, Xiao F, Liu J, Huang H, Li H, Liu J, Hou J. Dynamic single-cell RNA-seq analysis reveals distinct tumor program associated with microenvironmental remodeling and drug sensitivity in multiple myeloma. Cell Biosci. 2023 Jan 30;13（1）:19. doi: 10.1186/s13578-023-00971-2 . PMID: 36717896 ; PMCID: PMC9887807 .
